De methode biedt goedkope beeldvorming op de schaal van virusdeeltjes

Met behulp van een gewone lichtmicroscoop hebben MIT-ingenieurs een techniek bedacht om biologische monsters met een nauwkeurigheid van 10 nanometer af te beelden – waarmee ze virussen en mogelijk zelfs enkele biomoleculen kunnen afbeelden, zeggen de onderzoekers.

De nieuwe techniek bouwt voort op expansiemicroscopie, een benadering waarbij biologische monsters in een hydrogel worden ingebed en ze vervolgens worden geëxpandeerd voordat ze met een microscoop worden afgebeeld. Voor de nieuwste versie van de techniek hebben de onderzoekers een nieuw type hydrogel ontwikkeld dat een meer uniforme configuratie behoudt, waardoor een grotere nauwkeurigheid mogelijk is bij het afbeelden van kleine structuren.

Deze mate van nauwkeurigheid zou de deur kunnen openen naar het bestuderen van de moleculaire basisinteracties die het leven mogelijk maken, zegt Edward Boyden, de Y. Eva Tan professor in neurotechnologie, een professor in biologische engineering en hersen- en cognitieve wetenschappen aan het MIT, en een lid van MIT’s McGovern Institute for Brain Research en Koch Institute for Integrative Cancer Research.

“Als je individuele moleculen zou kunnen zien en kunt identificeren wat voor soort ze zijn, met een nauwkeurigheid van één cijfer tot nanometer, dan zou je misschien in staat zijn om daadwerkelijk naar de structuur van het leven te kijken. En structuur, zoals een eeuw van de moderne biologie ons heeft verteld, regeert functie ‘, zegt Boyden, de senior auteur van de nieuwe studie.

De hoofdauteurs van het artikel, dat vandaag verschijnt in Natuur Nanotechnologie, zijn MIT Research Scientist Ruixuan Gao en Chih-Chieh “Jay” Yu Ph.D. ’20. Andere auteurs zijn onder meer Linyi Gao Ph.D. ’20; voormalig MIT-postdoc Kiryl Piatkevich; Rachael Neve, directeur van de Gene Technology Core in het Massachusetts General Hospital; James Munro, universitair hoofddocent microbiologie en fysiologische systemen aan de University of Massachusetts Medical School; en Srigokul Upadhyayula, een voormalig assistent-professor kindergeneeskunde aan de Harvard Medical School en een assistent-professor in residentie van cel- en ontwikkelingsbiologie aan de University of California in Berkeley.

Lage kosten, hoge resolutie

Veel laboratoria over de hele wereld zijn begonnen met het gebruik van uitbreidingsmicroscopie sinds Boydens laboratorium het in 2015 voor het eerst introduceerde. Met deze techniek vergroten onderzoekers hun monsters fysiek ongeveer viervoudig in lineaire afmetingen voordat ze ze in beeld brengen, waardoor ze afbeeldingen met een hoge resolutie kunnen genereren zonder dure apparatuur. Het laboratorium van Boyden heeft ook methoden ontwikkeld om eiwitten, RNA en andere moleculen in een monster te labelen, zodat ze na expansie kunnen worden afgebeeld.

“Honderden groepen doen aan uitbreidingsmicroscopie. Er is duidelijk een opgekropte vraag naar een gemakkelijke, goedkope methode van nano-imaging”, zegt Boyden. “Nu is de vraag: hoe goed kunnen we worden? Kunnen we de nauwkeurigheid van één molecuul bereiken? Omdat je uiteindelijk een oplossing wilt bereiken die betrekking heeft op de fundamentele bouwstenen van het leven.”

Andere technieken zoals elektronenmicroscopie en beeldvorming met superresolutie bieden een hoge resolutie, maar de benodigde apparatuur is duur en niet algemeen toegankelijk. Uitbreidingsmicroscopie maakt echter beeldvorming met hoge resolutie mogelijk met een gewone lichtmicroscoop.

In een paper uit 2017 toonde het laboratorium van Boyden een resolutie van ongeveer 20 nanometer aan, met behulp van een proces waarbij monsters tweemaal werden uitgebreid voordat ze werden afgebeeld. Deze benadering, evenals de eerdere versies van expansiemicroscopie, is gebaseerd op een absorberend polymeer gemaakt van natriumpolyacrylaat, geassembleerd met behulp van een methode genaamd vrije radicalen synthese. Deze gels zwellen op bij blootstelling aan water; een beperking van deze gels is echter dat ze niet volledig uniform zijn in structuur of dichtheid. Deze onregelmatigheid leidt tot kleine vervormingen in de vorm van het monster wanneer het wordt uitgezet, waardoor de nauwkeurigheid die kan worden bereikt wordt beperkt.

Om dit te verhelpen, ontwikkelden de onderzoekers een nieuwe gel genaamd tetra-gel, die een meer voorspelbare structuur vormt. Door tetraëdrische PEG-moleculen te combineren met tetraëdrische natriumpolyacrylaten, konden de onderzoekers een roostervormige structuur creëren die veel uniformer is dan de door vrije radicalen gesynthetiseerde natriumpolyacrylaathydrogels die ze eerder gebruikten.

De onderzoekers toonden de nauwkeurigheid van deze aanpak aan door het te gebruiken om deeltjes van herpes simplex virus type 1 (HSV-1) uit te zetten, die een kenmerkende bolvorm hebben. Na het uitzetten van de virusdeeltjes vergeleken de onderzoekers de vormen met de vormen verkregen door elektronenmicroscopie en ontdekten dat de vervorming lager was dan die waargenomen met eerdere versies van uitbreidingsmicroscopie, waardoor ze een nauwkeurigheid van ongeveer 10 nanometer konden bereiken.

“We kunnen kijken hoe de arrangementen van deze eiwitten veranderen als ze worden uitgebreid en evalueren hoe dicht ze bij de bolvorm zijn. Zo hebben we het gevalideerd en vastgesteld hoe getrouw we de nanostructuur van de vormen en de relatieve ruimtelijke arrangementen van deze moleculen ‘, zegt Ruixuan Gao.

Enkele moleculen

De onderzoekers gebruikten hun nieuwe hydrogel ook om cellen uit te breiden, waaronder menselijke niercellen en hersencellen van muizen. Ze werken nu aan manieren om de nauwkeurigheid te verbeteren tot het punt waarop ze individuele moleculen in dergelijke cellen kunnen afbeelden. Een beperking van deze nauwkeurigheid is de grootte van de antilichamen die worden gebruikt om moleculen in de cel te labelen, die ongeveer 10 tot 20 nanometer lang zijn. Om individuele moleculen in beeld te brengen, zouden de onderzoekers waarschijnlijk kleinere labels moeten maken of de labels moeten toevoegen nadat de expansie is voltooid.

Ze onderzoeken ook of andere soorten polymeren, of gemodificeerde versies van het tetra-gelpolymeer, hen zouden kunnen helpen een grotere nauwkeurigheid te realiseren.

Als ze tot op enkele moleculen nauwkeurig kunnen zijn, zouden veel nieuwe grenzen kunnen worden verkend, zegt Boyden. Wetenschappers konden bijvoorbeeld een glimp opvangen van hoe verschillende moleculen met elkaar interageren, wat licht zou kunnen werpen op celsignaleringsroutes, activering van immuunrespons, synaptische communicatie, interacties tussen geneesmiddelen en vele andere biologische verschijnselen.

“We zouden graag naar gebieden van een cel kijken, zoals de synaps tussen twee neuronen of andere moleculen die betrokken zijn bij cel-celsignalering, en om erachter te komen hoe alle delen met elkaar praten”, zegt hij. “Hoe werken ze samen en hoe gaan ze fout bij ziektes?”