Op nanobody gebaseerde 3D-immunohistochemie maakt snelle visualisatie mogelijk in dikke weefselmonsters

Driedimensionale immunohistochemie (3D-IHC) heeft ons vermogen getransformeerd om de ruimtelijke opstelling van cellen en moleculen in intacte weefsels te visualiseren. Traditionele methoden zijn echter vaak tijdrovend en hebben last van slechte antilichaampenetratie, wat hun effectiviteit in diepe weefsels beperkt. Dit knelpunt heeft aanzienlijke uitdagingen aangegaan in neurowetenschappen, pathologie en biomedische beeldvorming, waarbij snelle en gedetailleerde mapping van grote weefselvolumes essentieel is.

Om deze kwesties aan te pakken, hebben onderzoekers van de Juntendo University in Tokio, Japan, universitair docent Kenta Yamauchi en professor Hiroyuki Hioki een nieuwe 3D-IHC-techniek ontwikkeld die de snelheid, diepte en gevoeligheid en gevoeligheid van immunolabeling in dikke weefselsamples dramatisch verbetert.

De studie-getiteld “een driedimensionale immunolabelingmethode met peroxidase-gefuseerde nanobodieën en fluorochromiseerde tyramide-glucose-oxidase-signaalversterking”, gepubliceerd op 18 juni 2025, in Communicatiebiologie—Brengt een methode met de naam POD-NAB/FT-GO 3D-IHC, die nanobodies combineert gefuseerd met peroxidase (POD-NAB’s) en een fluorescerend signaalamplificatiesysteem dat bekend staat als fluorochromiseerde tyramide-glucoseoxidase (FT-GO).

Deze benadering maakt de detectie van eiwitten in 1 mm dikke hersenweefsel binnen drie dagen mogelijk, een fractie van de tijd die nodig is door conventionele technieken.

“POD-NABS, Camelid NAB’s versmolten met pod, verbeterde immunolabelingdiepte en stelde gevoelige detecties in door te combineren met ons oorspronkelijke fluorescerende tyramidesignaalversterkingssysteem, FT-Go,” zei Dr. Yamauchi.

De onderzoekers begonnen met het aanpakken van een langdurige beperking in 3D-weefselimmunohistochemie: de slechte penetratie van conventionele immunoglobuline-antilichamen, die groot zijn in grootte (~ 150 kDa). Nanobodieën, afgeleid van camele -antilichamen, zijn slechts ~ 15 kDa en diffunderen daarom veel efficiënter in dikke weefsels.

Het team ontwikkelde nanobodieën gefuseerd met mierikswortelperoxidase, die de afzetting van fluorescerende tyramiden katalyseert via het FT-GO-systeem, waardoor labeling met hoge dichtheid van doelmoleculen mogelijk is.

Na het optimaliseren van weefselpermeabilisatie met een ureum-gebaseerde oplossing genaamd Scalea2, toonden de onderzoekers aan dat POD-NAB’s bijna uniforme etikettering konden bereiken over de volledige diepte van 1 mm muis hersenplakken. Conventionele antilichamen daarentegen hebben alleen de weefselperiferie bestempeld. Dit dieptevoordeel was duidelijk bij het labelen van zowel exogeen tot expressie gebrachte eiwitten zoals EGFP en tdtomato, evenals endogene doelen zoals integrine alfa m/cluster van differentiatiemolecuul 11b, een marker van microglia.

“Uitdoving van podactiviteit met nan₃ Multiplex immunolabeling van 3D-weefsels toegestaan ​​door POD-NAB/FT-GO-reactie, waardoor de veelzijdigheid aanzienlijk wordt verbeterd, “zei senior auteur Dr. Hioki.

De techniek bleek ook effectief in een ziektemodel. In hersenplakken van het ziektemodel van Alzheimer onthulde de methode geactiveerde microglia-clustering rond bèta-amyloïde plaques-een belangrijk kenmerk van neuro-ontsteking en ziekteprogressie. Dit toont veelbelovend voor het toepassen van de methode bij het bestuderen van neurodegeneratieve ziekten, tumor micro -omgevingen en immuunceldynamiek in weefsels.

Vergeleken met standaard fluorescerende eiwitbeeldvorming en directe labeling met synthetische fluorofoor-geconjugeerde nanobodieën, bood het POD-NAB/FT-GO-protocol tot negenvoudige grotere signaalintensiteit bij weefseldiepten van 500 micron. Deze substantiële signaalversterking vermindert de noodzaak van langdurige beeldvormingssessies, waardoor de methode bijzonder geschikt is voor analyse met hoge doorvoer.

Ondanks zijn voordelen heeft de methode enkele beperkingen. De auteurs merken op dat signaalhomogeniteit afneemt in weefsels dikker dan 1 mm. Bovendien zijn kwantitatieve vergelijkingen van antigeenexpressie een uitdaging vanwege de niet-lineaire aard van enzymatische signaalversterking. Een andere hindernis is de beperkte beschikbaarheid van nanobodieën die geschikt zijn voor histochemische etikettering, hoewel dit naar verwachting zal verbeteren naarmate meer nanobodie -sequenties publiekelijk beschikbaar worden.

Toch zijn de onderzoekers optimistisch over de bredere impact van hun techniek. Door belangrijke barrières in de penetratie van antilichamen en signaaldetectie te overwinnen, zou POD-NAB/FT-GO 3D-IHC een nieuwe standaard kunnen stellen in volumetrische beeldvorming van biologische weefsels. Dit innovatieve protocol opent niet alleen nieuwe deuren voor basisneurowetenschappen, maar biedt ook potentieel voor het bevorderen van klinische diagnostiek en ontdekking van geneesmiddelen. Met de groeiende vraag naar snelle beeldvorming met hoge resolutie weefsel, met name in hersenonderzoek en kankerbiologie, biedt de methode een tijdige en schaalbare oplossing.