Wetenschappers breken resolutierecords om individuele atomen te visualiseren met cryo-EM met één deeltje

GABA_EEN momentopnamen van de receptorkaart. (a) lokale afwikkeling; (b) de agonist pocket die histamine coördinatie en watermoleculen toont; (c) N-gebonden glycaan; (d) waterstofbindingsnetwerk onthuld door de verschilkaart (groene pieken).

Als we kijken naar de precieze driedimensionale rangschikking van atomen in een eiwit, kunnen we begrijpen hoe het zijn functies kan vervullen. Hoewel elektronenkryomicroscopie (cryo-EM) zich de laatste jaren snel heeft ontwikkeld als een belangrijke structurele biologietechniek, was röntgenkristallografie de enige techniek die individuele atomen kon visualiseren. De groepen van Radu Aricescu en Sjors Scheres in het MRC Laboratory of Molecular Biology, in samenwerking met wetenschappers van Thermo Fisher Scientific en elders, zijn nu voor het eerst in staat om individuele eiwitatomen op te lossen in een driedimensionaal cryo-EM-beeld.

Deze samenwerking begon begin 2019 toen Radu en Abhay Kotecha, een onderzoeker bij Thermo Fisher Scientific, nieuwe cryo-EM-hardware wilden testen op een klein membraaneiwitmonster. GABAA-receptoren, een focus van Radu’s onderzoek gedurende meer dan een decennium, werden gekozen omdat de hoogst haalbare resolutie met behulp van de best beschikbare technologie een limiet leek te hebben bereikt van ongeveer 2,5 Ångströms (Å), maar een hogere resolutie was duidelijk nodig voor een beter medicijnontwerp.

Wat is atomaire resolutie?

Resolutie wordt meestal gerapporteerd in Ångströms, een lengte-eenheid van een tien miljardste van een meter of 0,1 nanometer, en verwijst naar de kleinste afstand waartussen twee objecten gescheiden kunnen worden gezien.

De lengte van een typische koolstof-koolstofbinding is 1,5 A; andere bindingen in eiwitten zijn iets korter. Dus naarmate de resolutie daalt tot 1,2 A, wordt het mogelijk om individuele atomen in een eiwit te zien, waardoor echte atomaire resolutie wordt bereikt.

Tijdens het testen van nieuwe hardwareontwikkelingen, waaronder een elektronenbron voor een koudveldemissiekanon, een nieuw energiefilter en een nieuwe camera, moest het team ook nieuwe verwerkingsstrategieën ontwikkelen. Algoritmen voor de correctie van optische aberraties die eerder werden ontwikkeld door Jasenko Zivanov in de groep van Sjors, evenals een algoritme voorgesteld door Chris Russo en Richard Henderson, speelden een cruciale rol bij het persen van de meeste informatie uit de beelden.

Na het ontvangen van beelden verzameld op de nieuwe microscoophardware door Abhay Kotecha van Thermo Fisher Scientific in Eindhoven, Nederland, ontwikkelde Takanori Nakane, een postdoc in de groep van Sjors, een optimale workflow in RELION en Andrija Sente, samen met andere leden van de groep van Radu. deze workflow om GABAA-receptorbeelden te verwerken, terwijl de resultaten worden teruggekoppeld om de microscoopinstellingen snel te optimaliseren. Een nieuw gegevensopslagsysteem met hoge capaciteit, ontwikkeld door Jake Grimmett en Toby Darling in het Scientific Computing-team van het LMB, bood cruciale ondersteuning bij het verwerken van de ongeveer honderd terabytes aan gegenereerde gegevens. Deze aanhoudende teaminspanning leidde tot een ongekende GABAA-receptorstructuur met een resolutie van 1,7 A.

Dit was de best gerapporteerde resolutie die werd bereikt met cryo-EM voor elk ander eiwitmonster dan voor het eiwit apoferritine. Apoferritine wordt vaak gebruikt als maatstaf voor cryo-EM, omdat de moleculaire stabiliteit en 24-voudige symmetrie reconstructies met hoge resolutie van relatief weinig deeltjes mogelijk maakt.

Met behulp van de nieuwe hardware en verwerkingsstrategieën was het team in staat om een ​​apoferritinestructuur met een resolutie van 1,22 Å te verkrijgen, waarmee het het vorige record van 1,53 Å versloeg dat de hoogste resolutie cryo-EM-structuur met één deeltje tot nu toe is. Het meest indrukwekkend was dat deze resolutie visualisatie van individuele waterstofatomen mogelijk maakte, zelfs op watermoleculen in de eiwitstructuur. De visualisatie van waterstofbindende netwerken in eiwitstructuren en in medicijnbindende pockets stelt onderzoekers in staat om beter te begrijpen hoe ze werken.

Dit werk vertegenwoordigt het doorbreken van een belangrijke barrière voor cryo-EM als een structurele biologietechniek en de nieuwe technologie, gegevensverzameling en verwerkingsstrategieën zullen het aantal eiwitten uitbreiden waarvan de structuren kunnen worden opgelost tot een hoge resolutie. Deze reconstructies met een hogere resolutie zullen een beter begrip van de werking van eiwitten mogelijk maken en het ontwerp van meer specifieke geneesmiddelen vergemakkelijken die van invloed kunnen zijn op behandelingen voor een groot aantal ziekten.