Het zaadje planten voor DNA-nanoconstructies die op micronschaal groeien

Een team van nanobiotechnologen van het Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering van Harvard en het Dana-Farber Cancer Institute (DFCI) onder leiding van Wyss Founding Core Faculty-lid William Shih, Ph.D., heeft een programmeerbare strategie voor DNA-zelfassemblage ontwikkeld die de sleutel oplost. uitdaging van robuuste nucleatiecontrole en effent de weg voor toepassingen zoals ultragevoelige diagnostische biomarkerdetectie en schaalbare fabricage van micrometer-formaat structuren met nanometer-formaat kenmerken.

Met behulp van de methode, genaamd “kriskras-polymerisatie”, kunnen de onderzoekers het weven van nanoribbons uit langwerpige enkelvoudige strengen DNA (aangeduid als “latten”) initiëren door een strikt zaadafhankelijke kiemvorming. De studie is gepubliceerd in Nature Communications​

DNA-nanostructuren hebben een groot potentieel voor het oplossen van verschillende diagnostische, therapeutische en fabricage-uitdagingen vanwege hun hoge biocompatibiliteit en programmeerbaarheid. Om bijvoorbeeld effectieve diagnostische apparaten te laten functioneren, moet een DNA-nanostructuur mogelijk specifiek reageren op de aanwezigheid van een doelmolecuul door een versterkte uitlezing te activeren die compatibel is met goedkope instrumenten die toegankelijk zijn in point-of-care of klinische laboratoriumomgevingen.

De meeste DNA-nanostructuren worden samengesteld met behulp van een van de twee hoofdstrategieën die elk hun sterke punten en beperkingen hebben. “DNA-origami” wordt gevormd uit een lange enkelstrengige steigerstreng die in een twee- of driedimensionale configuratie wordt gestabiliseerd door talrijke kortere stapelstrengen. Hun montage is strikt afhankelijk van de steigerdraad, wat leidt tot robuust alles-of-niets vouwen. Hoewel ze onder een breed scala van omstandigheden met een hoge zuiverheid kunnen worden gevormd, is hun maximale grootte beperkt. “DNA-stenen” daarentegen kunnen veel grotere structuren samenstellen uit een veelvoud aan korte modulaire strengen. Hun assemblage vereist echter streng gecontroleerde omgevingscondities, kan vals worden geïnitieerd in afwezigheid van een zaadje en produceert een aanzienlijk deel van onvolledige structuren die moeten worden gezuiverd.

“De introductie van DNA-origami is de laatste twee decennia de meest impactvolle vooruitgang op het gebied van DNA-nanotechnologie. grotere lengteschalen ”, zegt Shih, die mede-leider is van het Wyss ‘Molecular Robotics Initiative, en tevens professor is aan de Harvard Medical School en DFCI. “We voorzien dat kriskras polymerisatie in grote lijnen de vorming van alles of niets mogelijk zal maken van twee- en driedimensionale microstructuren met adresseerbare kenmerken op nanoschaal, algoritmische zelfassemblage en signaalversterking zonder achtergrond in diagnostische toepassingen die extreme gevoeligheid vereisen.”

Een zaadje planten

Na de beperkingen van DNA-origami en nanostructuren van DNA-steentjes te hebben ervaren, begon het team met de vraag of het mogelijk was om de absolute zaadafhankelijkheid van DNA-origami-assemblage te combineren met de grenzeloze grootte van DNA-steenconstructies in een derde type DNA-nanostructuur die snel groeit. en consequent tot een groot formaat.

“We voerden aan dat alles-of-niets-assemblage van DNA-structuren op micronschaal kan worden bereikt door een systeem te ontwerpen dat een hoge vrije-energiebarrière heeft voor spontane assemblage. De barrière kan alleen worden omzeild met een zaadje dat zich bindt en een set rangschikt. van ‘kiemvormende’ lamellen voor het gezamenlijk opvangen van ‘groei’-lamellen. Dit initieert een kettingreactie van groei-lamellen-toevoegingen die resulteren in lange DNA-linten,’ zei co-eerste auteur Dionis Minev, Ph.D., die een postdoctoraal onderzoeker is op het team van Shih.

“Dit type van zeer coöperatieve, strikt zaadafhankelijke kiemvorming volgt enkele van dezelfde principes die de initiatie en groei van de cytoskeletale actine of microtubulusfilamenten en groei in cellen beheersen.” De verlenging van cytoskeletfilamenten volgt strikte regels waarbij elk binnenkomend monomeer zich bindt aan verschillende monomeren die eerder in het polymere filament zijn opgenomen en op hun beurt nodig zijn voor binding van de volgende. “Kriskras-polymerisatie tilt deze strategie naar een hoger niveau door ervoor te zorgen dat niet-naaste buren nodig zijn voor het rekruteren van inkomende monomeren. Het resulterende extreme niveau van coördinatie is de geheime saus”, zei Minev.

Van concept tot daadwerkelijke structuur (en)

Door hun concept in de praktijk te brengen, ontwierp en valideerde het team een ​​systeem waarin een kleine zaadstructuur een hoge beginconcentratie van voorgevormde bindingsplaatsen biedt in de vorm van uitstekende enkele DNA-strengen. Deze kunnen worden gedetecteerd door DNA-lamellen met zes (of in een alternatief kriskras acht) beschikbare bindingsplaatsen, die elk binden aan een van de zes (of acht) aangrenzende uitstekende ssDNA-strengen in een kriskras patroon, en daaropvolgende DNA-lamellen worden dan continu toegevoegd aan de langwerpige structuur.

“Ons ontwerp is opmerkelijk omdat we een snelle groei van enorme DNA-structuren hebben gerealiseerd, maar met een controle van de nucleatie die ordes van grootte groter is dan bij andere benaderingen. Het is alsof je je cake hebt en deze ook opeet, omdat we gemakkelijk grootschalige assemblages hebben gemaakt en deed dit alleen waar en wanneer we dat wilden, ”zei co-eerste auteur Chris Wintersinger, een Ph.D. student in de groep van Shih die samen met Minev aan het project heeft meegewerkt. “De controle die we met kriskras bereikten, overtreft aanzienlijk de controle die wordt waargenomen bij bestaande DNA-methoden waarbij nucleatie alleen kan worden gericht binnen een smal venster van omstandigheden waarin de groei buitengewoon traag is.”

Met behulp van kriskras-polymerisatie genereerde het team van Shih DNA-linten die zelf werden geassembleerd als resultaat van een enkele specifieke zaai-gebeurtenis tot structuren die tot tientallen micrometers lang waren, met een massa die bijna honderd keer groter was dan een typische DNA-origami. Bovendien creëerden de onderzoekers, door gebruik te maken van de hoge programmeerbaarheid van lamelconformaties en interacties, linten met verschillende bochten en wendingen, resulterend in opgerolde en buisachtige structuren.

In toekomstige studies zou dit kunnen worden gebruikt om gefunctionaliseerde structuren te creëren die kunnen profiteren van ruimtelijk gescheiden compartimenten. “Een onmiddellijke toepassing voor onze kriskras-nanoconstructiemethode is als een amplificatiestrategie in diagnostische assays die volgen op de vorming van nanoseeds uit specifieke en zeldzame biomarkers”, aldus co-auteur Anastasia Ershova, die ook een Ph.D. student begeleid door Shih.

“De ontwikkeling van deze nieuwe nanofabricagemethode is een treffend voorbeeld van hoe het Molecular Robotics Initiative van het Wyss Institute zich nog steeds laat inspireren door biologische systemen, in dit geval de groeiende filamenten van het cytoskelet, en de mogelijkheden op dit opwindende gebied blijft uitbreiden. potentieel van DNA-nanotechnologie dichter bij het oplossen van urgente diagnostische uitdagingen waarvoor momenteel geen oplossingen zijn, ” zei Wyss Founding Director Donald Ingber, MD, Ph.D., die ook de Judah Folkman Professor of Vascular Biology is aan de Harvard Medical School en Boston Children’s Ziekenhuis en hoogleraar Bioengineering aan de Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.