De microscopiemethode overwint de traditionele resolutielimiet voor het snel volgen van moleculen

Onderzoekers van de Ludwig Maximilian Universiteit (LMU) hebben een innovatieve methode ontwikkeld om tegelijkertijd snelle dynamische processen van meerdere moleculen op moleculaire schaal te volgen.

Processen in ons lichaam worden gekenmerkt door het samenspel van verschillende biomoleculen zoals eiwitten en DNA. Deze processen vinden plaats op een schaal die vaak binnen een bereik van slechts enkele nanometers ligt. Bijgevolg kunnen ze niet worden waargenomen met fluorescentiemicroscopie, die vanwege diffractie een resolutielimiet van ongeveer 200 nanometer heeft.

Wanneer twee kleurstoffen die de posities van biomoleculen markeren dichterbij zijn dan deze optische limiet, kan hun fluorescentie onder de microscoop niet worden onderscheiden. Omdat deze fluorescentie wordt gebruikt om ze te lokaliseren, wordt het nauwkeurig bepalen van hun posities onmogelijk.

Deze resolutielimiet wordt traditioneel overwonnen bij superresolutiemicroscopiemethoden door de kleurstoffen te laten knipperen en hun fluorescentie aan en uit te zetten. Hierdoor wordt hun fluorescentie tijdelijk gescheiden, waardoor deze onderscheidbaar wordt en lokalisaties onder de klassieke resolutielimiet mogelijk worden.

Voor toepassingen waarbij snelle dynamische processen worden bestudeerd, heeft deze truc echter een belangrijk nadeel: knipperen voorkomt de gelijktijdige lokalisatie van meerdere kleurstoffen. Dit vermindert de temporele resolutie aanzienlijk bij het onderzoeken van dynamische processen waarbij meerdere biomoleculen betrokken zijn.

Onder leiding van LMU-chemicus professor Philip Tinnefeld en in samenwerking met professor Fernando Stefani (Buenos Aires) hebben onderzoekers van LMU nu pMINFLUX-multiplexing ontwikkeld, een elegante benadering om dit probleem aan te pakken.

Het team heeft publiceerde een paper over hun werkwijze in het journaal Natuur Fotonica.

MINFLUX is een microscopiemethode met superresolutie, die lokalisaties met een nauwkeurigheid van slechts één nanometer mogelijk maakt. In tegenstelling tot conventionele MINFLUX registreert pMINFLUX het tijdsverschil tussen de excitatie van kleurstoffen met een laserpuls en de daaropvolgende fluorescentie met een resolutie van minder dan nanoseconden.

Naast het lokaliseren van de kleurstoffen biedt dit inzicht in een andere fundamentele eigenschap van hun fluorescentie: hun fluorescentielevensduur. Dit beschrijft hoe lang het gemiddeld duurt voordat een kleurstofmolecuul fluoresceert nadat het is opgewonden.

“De levensduur van de fluorescentie hangt af van de gebruikte kleurstof”, legt Fiona Cole, co-eerste auteur van de publicatie, uit. “We hebben gebruik gemaakt van verschillen in de levensduur van fluorescentie bij het gebruik van verschillende kleurstoffen om de fluorescerende fotonen toe te wijzen aan de kleurstof die werd uitgezonden zonder de noodzaak van knipperen en de daaruit voortvloeiende tijdelijke scheiding.”

Voor dit doel hebben de onderzoekers het lokalisatiealgoritme aangepast en een multi-exponentieel fitmodel toegevoegd om de vereiste scheiding te bereiken.

“Hierdoor konden we de positie van meerdere kleurstoffen tegelijkertijd bepalen en snelle dynamische processen tussen meerdere moleculen met nanometerprecisie onderzoeken”, voegt Jonas Zähringer, tevens mede-eerste auteur, toe.

De onderzoekers demonstreerden hun methode door nauwkeurig twee DNA-strengen te volgen terwijl ze tussen verschillende posities op een DNA-origami-nanostructuur sprongen, door translationele en rotatiebewegingen van een DNA-origami-nanostructuur te scheiden en door de afstand tussen antigeenbindende plaatsen van antilichamen te meten.

“Maar dit is nog maar het begin”, zegt Philip Tinnefeld. “Ik ben er zeker van dat pMINFLUX-multiplexing, met zijn hoge temporele en ruimtelijke resolutie, in de toekomst nieuwe inzichten zal opleveren in eiwitinteracties en andere biologische verschijnselen.”