Helderdere fluorescerende markeringen zorgen voor fijnere beeldvorming

Onderzoekers van de McKelvey School of Engineering aan de Washington University in St. Louis hebben een nieuwe techniek ontwikkeld die beeldvorming met een hogere resolutie van zeer kleine objecten zoals neuronen mogelijk maakt. De techniek, die een verbetering is van een bestaande methode genaamd expansiemicroscopie, wordt beschreven in een nieuw artikel dat in het tijdschrift is gepubliceerd Nano-brieven.

De meeste mensen zijn bekend met microscopen die lenzen gebruiken om een ​​object groter te laten lijken en gemakkelijker te zien met het menselijk oog. Maar expansiemicroscopie (ExM) werkt praktisch op de tegenovergestelde manier: door het object zelf groter te maken. Wetenschappers coaten het monster – bijvoorbeeld een cel – met kleine lichtgevende markeringen, fluoroforen genaamd, en sluiten het monster vervolgens in een gel in die uitzet wanneer het in contact komt met water. Naarmate het monster groter wordt, volgen de fluorescerende labels de contouren van kenmerken die te klein zijn om te zien, zoals de dunne takken of dendrieten die uit hersencellen groeien.

Maar expansiemicroscopie heeft een grote tekortkoming. Het lichtsignaal dat wordt uitgezonden door conventionele fluoroforen verliest veel van zijn intensiteit (meer dan 50%) tijdens de voorbereidings- en uitbreidingsstappen.

“Als je dingen groter maakt, is dat niet noodzakelijkerwijs goed, want als je de hoeveelheid signaal dat al aanwezig is niet verandert, wordt dat signaal zwakker”, zegt Barani Raman, hoogleraar biomedische technologie.

Raman en Srikanth Singamaneni, de professor Lilyan & E. Lisle Hughes bij de afdeling Werktuigbouwkunde en materiaalkunde, hebben dit probleem aangepakt door ultraheldere fluorescerende markers te gebruiken die plasmonic-fluors (PF’s) worden genoemd. Singamaneni ontwikkelde de PF’s voor andere toepassingen in 2020.

“Het is een mooi voorbeeld van twee mensen met totaal verschillende expertise die een toevallig gesprek hebben en zeggen:” Oké, dit probleem is hier in één veld, maar de oplossing is er in een ander veld, “zei Raman. Het team heeft zijn nieuwe techniek “plasmon-enhanced expansiemicroscopie” of p-ExM genoemd.

De plasmonic-fluor is opgebouwd uit een kerndeeltje goud gewikkeld in een zilveren omhulsel, dat vervolgens wordt bedekt met een laag andere materialen, waaronder conventionele fluoroforen. De structuur is ontworpen om de fluoroforen te beschermen tegen de agressieve chemicaliën die in het proces worden gebruikt en om het lichtsignaal van de fluoroforen veel helderder te maken. De techniek zal onderzoekers helpen bij het in kaart brengen van neurale netwerken of de verbindingen tussen neuronen.

“Het metalen nanodeeltje dient als een antenne, wat betekent dat het meer licht in de fluoroforen kan trekken”, zei Singamaneni. De interactie tussen het goud-zilver nanodeeltje en de fluoroforen zorgt er ook voor dat de fluoroforen meer fotonen uitzenden dan normaal. Als gevolg hiervan is de plasmonic-fluor bijna vier ordes van grootte helderder dan de fluorescerende markeringen op zichzelf zouden zijn. Plasmonische fluor lost ook het probleem van signaalverdunning op omdat de fluorescerende markeringen direct aan het nanodeeltje zijn bevestigd, zodat ze niet uit elkaar spreiden wanneer het monster uitzet.

Om het potentieel van plasmon-versterkte expansiemicroscopie aan te tonen, gebruikten de onderzoekers het om een ​​monster van neuronen uit het hippocampusgebied van de hersenen te bestuderen. In sommige gevallen zijn de ontluikende takken van het neuron, neurieten genaamd, te dicht bij elkaar om te onderscheiden zonder de hulp van technieken zoals expansiemicroscopie.

“Als twee neurieten te dicht bij elkaar staan, kunnen we ze niet oplossen. De software denkt dat ze slechts één neuriet zijn”, zei Singamaneni.

Na het labelen van de cellen met de ultraheldere plasmonic-fluors en het uitbreiden van het monster, kon het team het aantal neurieten tellen, het totale gebied van de neurieten kwantificeren en de lengte van individuele neurieten meten. Ze identificeerden 2,5 keer meer neurieteindpunten dan zichtbaar waren voordat het monster werd uitgebreid.

Toen het team de prestaties van de plasmonic-fluor vergeleek met de fluoroforen zelf, ontdekten ze dat de plasmonic-fluor ongeveer 76% van het lichtsignaal vasthield, terwijl de fluoroforen minder dan 16% vasthielden. De resultaten van het team toonden ook aan dat plasmon-versterkte expansiemicroscopie compatibel is met bestaande expansiemicroscopieprotocollen, wat betekent dat plasmonische fluors kunnen worden gebruikt in plaats van conventionele fluoroforen in toekomstige studies. PF’s kunnen ook worden gemaakt op basis van een bepaalde fluorofoor die past bij de behoeften van onderzoekers.