Microscopietechniek onthult verborgen nanostructuren in cellen en weefsels

In een levende cel zijn eiwitten en andere moleculen vaak dicht op elkaar gepakt. Deze dichte clusters kunnen moeilijk in beeld te brengen zijn omdat de fluorescerende labels die worden gebruikt om ze zichtbaar te maken zich niet tussen de moleculen kunnen klemmen.

MIT-onderzoekers hebben nu een nieuwe manier ontwikkeld om deze beperking te overwinnen en die “onzichtbare” moleculen zichtbaar te maken. Hun techniek stelt hen in staat om de moleculen te “de-crowden” door een cel- of weefselmonster uit te breiden voordat ze de moleculen labelen, waardoor de moleculen toegankelijker worden voor fluorescerende tags.

Deze methode, die voortbouwt op een veelgebruikte techniek die bekend staat als expansiemicroscopie, eerder ontwikkeld aan het MIT, moet wetenschappers in staat stellen om moleculen en celstructuren te visualiseren die nog nooit eerder zijn gezien.

“Het wordt duidelijk dat het expansieproces veel nieuwe biologische ontdekkingen zal onthullen. Als biologen en clinici een eiwit in de hersenen of een ander biologisch exemplaar hebben bestudeerd en ze het op de normale manier labelen, missen ze misschien hele categorieën van fenomenen “, zegt Edward Boyden, de Y. Eva Tan Professor in Neurotechnology, een professor in biologische engineering en hersen- en cognitieve wetenschappen aan het MIT, een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute en een lid van MIT’s McGovern Institute for Brain Research en Koch Institute for Integrative Kankeronderzoek.

Met behulp van deze techniek toonden Boyden en zijn collega’s aan dat ze een nanostructuur in de synapsen van neuronen konden afbeelden. Ze brachten ook de structuur van aan de ziekte van Alzheimer gekoppelde amyloïde bèta-plaques gedetailleerder in beeld dan voorheen mogelijk was.

“Onze technologie, die we expansie onthullend noemden, maakt visualisatie mogelijk van deze nanostructuren, die voorheen verborgen bleven, met behulp van hardware die gemakkelijk verkrijgbaar is in academische laboratoria”, zegt Deblina Sarkar, een assistent-professor in het Media Lab en een van de hoofdauteurs van de studie .

De senior auteurs van de studie zijn Boyden; Li-Huei Tsai, directeur van MIT’s Picower Institute for Learning and Memory; en Thomas Blanpied, een professor in de fysiologie aan de Universiteit van Maryland. Andere hoofdauteurs zijn onder meer Jinyoung Kang, een MIT-postdoc, en Asmamaw Wassie, een recente MIT Ph.D. ontvanger. De studie verschijnt vandaag in Natuur Biomedische Technologie.

Ontvolking

Om een ​​specifiek eiwit of ander molecuul in een cel af te beelden, moet het worden gelabeld met een fluorescerend label dat wordt gedragen door een antilichaam dat aan het doelwit bindt. Antilichamen zijn ongeveer 10 nanometer lang, terwijl typische cellulaire eiwitten meestal een diameter van ongeveer 2 tot 5 nanometer hebben, dus als de doeleiwitten te dicht op elkaar zijn gepakt, kunnen de antilichamen ze niet bereiken.

Dit was een obstakel voor traditionele beeldvorming en ook voor de originele versie van expansiemicroscopie, die Boyden voor het eerst ontwikkelde in 2015. In de originele versie van expansiemicroscopie bevestigden onderzoekers fluorescerende labels aan moleculen van belang voordat ze het weefsel uitbreidden. Het labelen gebeurde eerst, onder meer omdat de onderzoekers een enzym moesten gebruiken om eiwitten in het monster te hakken, zodat het weefsel kon worden uitgebreid. Dit betekende dat de eiwitten niet konden worden gelabeld nadat het weefsel was uitgebreid.

Om dat obstakel te overwinnen, moesten de onderzoekers een manier vinden om het weefsel uit te breiden terwijl de eiwitten intact bleven. Ze gebruikten warmte in plaats van enzymen om het weefsel te verzachten, waardoor het weefsel 20-voudig kon uitzetten zonder te worden vernietigd. Vervolgens konden de gescheiden eiwitten na expansie worden gelabeld met fluorescerende tags.

Met zoveel meer eiwitten die toegankelijk zijn voor labeling, waren de onderzoekers in staat om kleine cellulaire structuren te identificeren in synapsen, de verbindingen tussen neuronen die dicht opeengepakt zijn met eiwitten. Ze labelden en beeldden zeven verschillende synaptische eiwitten af, waardoor ze in detail “nanokolommen” konden visualiseren, bestaande uit calciumkanalen die zijn uitgelijnd met andere synaptische eiwitten. Deze nanokolommen, waarvan wordt aangenomen dat ze de synaptische communicatie efficiënter maken, werden voor het eerst ontdekt door het laboratorium van Blanpied in 2016.

“Deze technologie kan worden gebruikt om veel biologische vragen te beantwoorden over disfunctie in synaptische eiwitten, die betrokken zijn bij neurodegeneratieve ziekten”, zegt Kang. “Tot nu toe was er geen tool om synapsen goed te visualiseren.”

Nieuwe patronen

De onderzoekers gebruikten hun nieuwe techniek ook om bèta-amyloïde in beeld te brengen, een peptide dat plaques vormt in de hersenen van Alzheimerpatiënten. Met behulp van hersenweefsel van muizen ontdekten de onderzoekers dat amyloïde bèta periodieke nanoclusters vormt, die nog niet eerder waren gezien. Deze clusters van amyloïde bèta bevatten ook kaliumkanalen. De onderzoekers vonden ook amyloïde bèta-moleculen die spiraalvormige structuren langs axonen vormden.

“In dit artikel speculeren we niet over wat die biologie zou kunnen betekenen, maar we laten zien dat het bestaat. Dat is slechts één voorbeeld van de nieuwe patronen die we kunnen zien”, zegt Margaret Schroeder, een afgestudeerde MIT-student die is ook een auteur van het papier.

Sarkar zegt dat ze gefascineerd is door de biomoleculaire patronen op nanoschaal die deze technologie onthult. “Met een achtergrond in nano-elektronica heb ik elektronische chips ontwikkeld die extreem nauwkeurige uitlijning vereisen, in de nanofab. Maar als ik zie dat Moeder Natuur in ons brein biomoleculen heeft gerangschikt met zo’n precisie op nanoschaal, dan ben ik echt verbluft”, zegt ze.

Boyden en zijn groepsleden werken nu samen met andere laboratoria om celstructuren te bestuderen, zoals eiwitaggregaten die verband houden met Parkinson en andere ziekten. In andere projecten bestuderen ze ziekteverwekkers die cellen en moleculen infecteren die betrokken zijn bij veroudering in de hersenen. Voorlopige resultaten van deze onderzoeken hebben ook nieuwe structuren aan het licht gebracht, zegt Boyden.

“Je ziet keer op keer dingen die echt schokkend zijn”, zegt hij. “Het laat ons zien hoeveel we missen met klassieke niet-geëxpandeerde kleuring.”

De onderzoekers werken ook aan het aanpassen van de techniek, zodat ze tot 20 eiwitten tegelijk in beeld kunnen brengen. Ze werken ook aan het aanpassen van hun proces, zodat het kan worden gebruikt op menselijke weefselmonsters.

Sarkar en haar team ontwikkelen daarentegen kleine draadloos aangedreven nano-elektronische apparaten die in de hersenen kunnen worden verspreid. Ze zijn van plan om deze apparaten te integreren met onthulling van de uitbreiding. “Dit kan de intelligentie van nano-elektronica combineren met de nanoscopische bekwaamheid van expansietechnologie, voor een geïntegreerd functioneel en structureel begrip van de hersenen”, zegt Sarkar.