Nieuw beeldvormingsplatform bevordert de 3D-visualisatie van cellulaire structuren op nanoschaal

Een team van onderzoekers onder leiding van Anna-Karin Gustavsson van Rice University heeft een innovatief beeldvormingsplatform ontwikkeld dat belooft ons begrip van cellulaire structuren op nanoschaal te verbeteren.

Dit platform, genaamd soTILT3D voor gekantelde lichtplaten met één objectief en 3D-puntspreidingsfuncties (PSF’s), biedt aanzienlijke vooruitgang op het gebied van microscopie met superresolutie, waardoor snelle en nauwkeurige 3D-beeldvorming van meerdere cellulaire structuren mogelijk is, terwijl de extracellulaire omgeving kan worden gecontroleerd en flexibel kan worden aangepast .

Het onderzoek is gepubliceerd in Natuurcommunicatie.

Het bestuderen van cellen op nanoschaal biedt inzicht in de ingewikkelde mechanismen die cellulair gedrag aandrijven, waardoor onderzoekers details kunnen ontdekken die essentieel zijn voor het begrijpen van gezondheid en ziekte. Deze details kunnen onthullen hoe moleculaire interacties bijdragen aan cellulaire functies, wat van cruciaal belang is voor het bevorderen van gerichte therapieën en het begrijpen van ziektepathogenese.

Hoewel conventionele fluorescentiemicroscopie nuttig is geweest voor het bestuderen van cellulaire structuren, wordt deze beperkt door de diffractie van licht, waardoor het vermogen om kenmerken kleiner dan een paar honderd nanometer op te lossen wordt beperkt.

Hoewel superresolutiemicroscopie met één molecuul baanbrekende inzichten heeft opgeleverd in biologische structuren op nanoschaal, lijden bestaande technieken bovendien vaak onder hoge achtergrondfluorescentie en lage beeldsnelheden, vooral als het gaat om dikke monsters of complexe celaggregaten. Ze missen doorgaans ook een nauwkeurige, aanpasbare controle over de monsteromgeving.

Het soTILT3D-platform pakt deze uitdagingen rechtstreeks aan. Door synergetisch een schuine lichtplaat, een nanogeprint microfluïdisch systeem en geavanceerde computerhulpmiddelen te integreren, verbetert soTILT3D de beeldprecisie en -snelheid aanzienlijk, waardoor een duidelijkere visualisatie mogelijk wordt van hoe verschillende cellulaire structuren op nanoschaal op elkaar inwerken, zelfs in conventioneel uitdagende monsters.

Belangrijkste innovaties

Het soTILT3D-platform maakt gebruik van een gekantelde lichtplaat met één objectief om selectief dunne plakjes van een monster te verlichten, waardoor het contrast effectief wordt verbeterd door de achtergrondfluorescentie uit onscherpe gebieden te verminderen, vooral in dikke biologische monsters zoals zoogdiercellen.

“De lichtplaat wordt gevormd met behulp van dezelfde objectieflens als gebruikt in de microscoop voor beeldvorming, en is volledig bestuurbaar, geditherd om schaduwartefacten te verwijderen die gebruikelijk zijn bij lichtplaatmicroscopie en onder een hoek geplaatst om beeldvorming tot aan het dekglaasje mogelijk te maken. ” zei Gustavsson, assistent-professor scheikunde bij Rice en corresponderende auteur van de studie.

“Hierdoor kunnen we hele monsters van boven tot onder met verbeterde precisie in beeld brengen.”

Het platform bevat ook een op maat ontworpen microfluïdisch systeem met een ingebedde, aanpasbare gemetalliseerde microspiegel, die nauwkeurige controle over de extracellulaire omgeving mogelijk maakt en snelle oplossingsuitwisseling mogelijk maakt, wat ideaal is voor sequentiële multitarget-beeldvorming zonder kleurverschuivingen en tegelijkertijd reflectie van het licht mogelijk maakt. blad in het monster.

“Het ontwerp en de geometrie van de microfluïdische chip en het nanogeprinte inzetstuk met de microspiegel kunnen eenvoudig worden aangepast voor verschillende monsters en lengteschalen, wat veelzijdigheid biedt in verschillende experimentele opstellingen”, zegt Nahima Saliba, co-eerste auteur van het artikel samen met collega-afgestudeerde student Gabriella. Gagliano, die ook verbonden is aan het Smalley-Curl Institute en het Applied Physics Graduate Program bij Rice.

Bovendien maakt soTILT3D gebruik van computationele hulpmiddelen zoals deep learning voor analyse van hogere fluorofoorconcentraties voor verbeterde beeldsnelheid en algoritmen voor real-time driftcorrectie, waardoor stabiele, uiterst nauwkeurige beeldvorming over langere tijdsperioden mogelijk wordt.

“De PSF-techniek van het platform maakt 3D-beeldvorming van afzonderlijke moleculen mogelijk, terwijl deep learning omgaat met dichte emitteromstandigheden waar conventionele algoritmen moeite mee hebben, wat de acquisitiesnelheid aanzienlijk verbetert”, aldus Saliba.

Het microfluïdische apparaat van SoTILT3D ondersteunt ook geautomatiseerde Exchange-PAINT-beeldvorming, waardoor verschillende doelen opeenvolgend kunnen worden gevisualiseerd zonder de kleurverschuivingen die gebruikelijk zijn bij meerkleurige benaderingen bij diepgaande beeldvorming op nanoschaal.

Baanbrekende resultaten

Het soTILT3D-platform heeft opmerkelijke verbeteringen laten zien op het gebied van beeldprecisie en snelheid. De schuine lichtplaat van het platform verbetert de signaal-achtergrondverhouding voor cellulaire beeldvorming tot zes keer in vergelijking met traditionele epi-verlichtingsmethoden, waardoor het contrast wordt verbeterd en nauwkeurige lokalisatie op nanoschaal mogelijk wordt gemaakt.

“Dit detailniveau onthult ingewikkelde aspecten van de 3D-celarchitectuur die traditioneel moeilijk waar te nemen waren met conventionele benaderingen”, zegt Gagliano.

In termen van snelheid levert soTILT3D een tienvoudige toename op in combinatie met een hoge emitterdichtheid en deep learning-analyse, waardoor onderzoekers in een fractie van de gebruikelijke tijd gedetailleerde beelden kunnen vastleggen van complexe structuren zoals de nucleaire lamina, mitochondriën en celmembraaneiwitten in hele cellen. .

Bovendien ondersteunt het platform nauwkeurige 3D-multitarget-beeldvorming van hele cellen, waarbij de verdeling van meerdere eiwitten binnen een hele cel wordt vastgelegd en de afstanden op nanoschaal daartussen worden gemeten.

Onderzoekers kunnen nu de ruimtelijke rangschikking van dichtbij gelegen eiwitten zoals nucleaire lamina-eiwitten lamin B1 en lamin A/C en lamina-geassocieerd eiwit 2 met opmerkelijke precisie en nauwkeurigheid visualiseren, wat nieuwe inzichten biedt in eiwitorganisaties en hun rol bij het reguleren van de cellulaire functie.

Brede toepassingen in de biologie en geneeskunde

Het soTILT3D-platform opent nieuwe mogelijkheden voor onderzoekers op verschillende terreinen. De mogelijkheid om complexe monsters in beeld te brengen, inclusief stamcelaggregaten, breidt de toepassing ervan uit tot buiten individuele cellen.

De biocompatibiliteit van het microfluïdische systeem maakt het geschikt voor beeldvorming met levende cellen, waardoor wetenschappers cellulaire reacties op verschillende stimuli in realtime kunnen bestuderen met minder fotoschade. De nauwkeurig gecontroleerde oplossingsuitwisselingsfunctie maakt soTILT3D ook tot een ideaal hulpmiddel om in realtime te testen hoe medicijnbehandelingen de cellen beïnvloeden.

“Ons doel met soTILT3D was om een ​​flexibel beeldvormingshulpmiddel te creëren dat de beperkingen van traditionele superresolutiemicroscopie overwint”, aldus Gustavsson.

“We hopen dat deze vooruitgang de studies in de biologie, biofysica en biogeneeskunde zal verbeteren, waarbij ingewikkelde interacties op nanoschaal de sleutel zijn tot het begrijpen van de cellulaire functie in de gezondheid en pathogenese.”