Onderzoekers ontwikkelen een economisch hulpmiddel om de identificatie van ziekteverwekkende pathogenen te vergemakkelijken

SMU-expert op het gebied van nanotechnologie, MinJun Kim, heeft een team onderzoekers van de Universiteit van Texas in Austin geholpen een goedkopere manier te ontwikkelen om de vertering van nucleases te detecteren – een van de cruciale stappen in veel toepassingen voor nucleïnezuurdetectie, zoals die worden gebruikt om COVID-19 te identificeren.

Nucleïnezuurdetectie is de belangrijkste methode voor het identificeren van ziekteverwekkers die infectieziekten veroorzaken. Omdat er tijdens de COVID-19-pandemie elke dag wereldwijd miljoenen PCR-tests werden uitgevoerd, is het belangrijk om de kosten van deze tests te verlagen.

Een onderzoek gepubliceerd in het journaal Natuur Nanotechnologie laat zien dat dit goedkope hulpmiddel, Subak genaamd, effectief is in het bepalen wanneer nuclease-digestie heeft plaatsgevonden, dat wil zeggen wanneer een enzym genaamd nuclease nucleïnezuren, zoals DNA of RNA, in kleinere fragmenten afbreekt.

De traditionele manier om nuclease-activiteit te identificeren, de Fluorescentie Resonantie Energie Transfer (FRET)-sonde, kost 62 keer meer om te produceren dan de Subak-reporter.

“Subak-reporter is kosteneffectiever en eenvoudiger dan op FRET gebaseerde systemen en biedt een alternatieve methode voor het detecteren van nuclease-activiteit”, zegt Kim, de Robert C. Womack-leerstoel aan de Lyle School of Engineering bij SMU en hoofdonderzoeker van het BAST Lab. . “Veel nucleïnezuurdetectiemethoden, zoals PCR en DETECTR, vertrouwen tegenwoordig nog steeds op het gebruik van FRET-sondes in hun laatste stappen.”

In tegenstelling tot PCR is DETECTR (DNA-endonuclease-targeted CRISPR trans reporter) een eenvoudiger assay of test die afhankelijk is van CRISPR-Cas-nuclease voor de detectie van pathogeen DNA. Kim en de onderzoekers van UT Austin hebben met succes de FRET-sonde vervangen door een Subak-reporter in de DETECTR-test, waardoor de testkosten aanzienlijk zijn verlaagd.

Subak-reporters zijn gebaseerd op een speciale klasse van zogenaamde fluorescerende zilveren nanoclusters. Ze bestaan ​​uit 13 zilveratomen die rond een korte DNA-streng zijn gewikkeld: een organisch/anorganisch samengesteld nanomateriaal dat te klein is om met het blote oog zichtbaar te zijn en in grootte varieert van 1 tot 3 nanometer (een miljardste van een meter). .

Nanomaterialen op deze lengteschaal kunnen zeer lichtgevend zijn, zoals kwantumdots, en verschillende kleuren vertonen. Fluorescerende nanomaterialen hebben toepassingen gevonden in tv-schermen en in biosensoren, zoals de Subak-reporter.

Hoofdonderzoeker Tim Yeh, universitair hoofddocent biomedische technologie aan de Cockrell School of Engineering aan de UT Austin, en zijn team hebben de Subak-reporters geprogrammeerd om een ​​andere kleur uit te zenden wanneer ze worden verteerd door nucleasen.

“Deze zilveren nanoclusters met DNA-sjabloon zenden aanvankelijk groene fluorescentie uit, maar ondergaan een opmerkelijke kleurverandering naar helder rood wanneer DNA wordt gefragmenteerd door nucleasen, ” zei Kim. “De kleurverandering van Subak-reporters is gemakkelijk zichtbaar onder een UV-lamp”, ook al is het eigenlijke apparaat minuscuul.

Subak-reporters kosten slechts $ 1 per nanomolecuul om te maken. FRET daarentegen, waarvoor verschillende fluorescerende kleurstoffen nodig zijn die meer nodig hebben om resultaten te krijgen, kost $ 62 per nanomolecuul om te produceren, zei Kim.

Kim en Madhav L. Ghimire, SMU’s Dean’s Postdoctoral Fellow aan de Moody School of Graduate and Advanced Studies van SMU, werkten samen met Yeh om de zilveren nanoclusters van DNA/AgNC te optimaliseren en te karakteriseren. Dit omvatte het verhogen van de intensiteit van de groene en rode fluorescentie voor en na fragmentatie door nucleasen.

Karakterisering omvatte het bevestigen van de grootte, structuur en de stabiliteit van de nanoclusters in specifieke omgevingen.

“Optimalisatie van deze goedkope detectoren is essentieel om hun fluorescentie-eigenschappen te monitoren, de stabiliteit van nanoclusters te garanderen, de grootte en structuur te controleren, en vooral om hun gevoeligheid en selectiviteit in verschillende omgevingsomstandigheden te verbeteren, waardoor ze betrouwbaarder worden voor het detectiedoel”, zegt Ghimire. gezegd.

Naast het verder testen van de Subak-reporter op nucleasevertering, wil het team ook onderzoeken of deze een sonde kan zijn voor andere biologische doelwitten.