Realtime beeldvorming laat zien hoe SARS-CoV-2 menselijke cellen aanvalt

“Wat we hier doen, is de binding van de piek aan ACE 2 in feite visualiseren [angiotensin converting enzyme 2], “zegt Kirill Gorshkov, een onderzoeker aan de Nationaal centrum voor het bevorderen van translationele wetenschappen (NCATS) in Maryland, VS.

Hoe onschadelijk dit ook mag klinken voor niet-ingewijden, deze binding is de eerste stap in een proces van virale proliferatie dat mogelijk heeft geleid tot de ergste pandemie sinds mensenheugenis. De “piek” is een eiwit op het SARS-CoV-2-virus dat algemeen wordt erkend als het primaire aanvalswapen voor het mobiliseren van zijn virale DNA in een gastheercel. De ACE2-receptoren zijn menselijke celeiwitten die effectief de deur openen voor deze aanval. Met behulp van biotechnologische kwantumstippen, Gorshkov en Eunkeu Oh bij de Naval Research Laboratory (NRL) in Washington, DC, en hun collega’s waren in staat om de binding en daaropvolgende internalisatie in beeld te brengen die plaatsvindt wanneer ACE2 en het spike-eiwit een interactie aangaan. “Je kunt dat in realtime zien gebeuren”, voegt Gorshkov eraan toe, “dat is het mooie van deze test en daarom denken we dat het belangrijk zal zijn voor drugsscreening.”

Een virus kan zich niet voortplanten zonder een gastheercel in te schrijven, dus onderzoekers over de hele wereld hebben gewerkt om te begrijpen hoe SARS-CoV-2 interageert met en binnendringt in cellen met als doel dit stadium te blokkeren en het ontstaan ​​van COVID19 te voorkomen. Gorshkov en zijn collega’s bij NCATS waren al bezig met verschillende beeldvormende assays voor kankers, virussen en lysosomale stapelingsziekten, “maar toen het coronavirus toesloeg, moesten we snel schakelen”, zegt Gorshkov.

Eerder SARS-onderzoek had het belang van interacties met ACE2 in menselijke cellen voor de verspreiding van dit soort virussen aangetoond, en ze waren al in staat om deze receptoreiwitten te taggen met een groen fluorescerend eiwit om hun bewegingen in beeld te brengen. Het bewijs stapelde zich ook op om de specifieke spike-eiwitten op SARS-CoV-2 te lokaliseren die ACE2 in een bolwerk zouden kunnen vergrendelen, zodat het virus de cel kan binnendringen. De informatie over interacties met spike-eiwitten is echter meestal indirect verkregen uit biochemische of nabijheidsassays en tests met eiwitten en delen van eiwitten die uit het virus zijn gehaald – ‘pseudo-viro-deeltjes’. Zonder fluorescerende labeling van deze virale eiwitten, bleef hun rol in de ACE2-receptorbinding en daaropvolgende internalisatie – endocytose – effectief spelen onder dekking van duisternis tot beeldvorming.

Bij het NRL wilden onderzoekers ook hun expertise met nanodeeltjes voor cellulaire levering en biosensoren gebruiken om te helpen bij het zoeken naar anti-COVID19-geneesmiddelen. Oh ging op zoek naar mogelijke manieren om de eiwit-nanostructuur-vervoegingstechnieken toe te passen waarmee ze al meer dan 15 jaar werkte. Met twee proteïnen die een bindingsaffiniteit delen – een kwantumstip gehecht aan de ene en een fluorescerend nanodeeltje gehecht aan de andere – zal de binding tussen de twee proteïnen de nanostructuren dichtbij genoeg brengen voor energieoverdracht tussen hen.

De resulterende fluorescentie-uitdoving stelt de onderzoekers vervolgens in staat de eiwitbinding te volgen. “Als je een remmer in het midden hebt om de binding te stoppen, kan deze worden gebruikt als remmingstest voor het screenen van geneesmiddelen, dus we gebruiken dit veel”, legt Oh uit. Toen Oh en haar team onder leiding van Mason Wolak de mogelijke toepassing zagen voor het screenen van antilichamen tegen COVID19, presenteerden ze hun ideeën aan het team van NCATS, en de twee instellingen gingen meteen aan de slag om het verder te ontwikkelen.

Een “pseudovirion” ontwikkelen

De eerste stap van Oh’s kant van de samenwerking was het ontwikkelen van een ‘pseudovirion’ met de krachtige delen van SARS-CoV-2-spike-eiwitten (waar het receptorbindende domein zich bevindt) die zodanig aan de kwantumdip zijn bevestigd dat de spike-eiwitten blijf cellen aanvallen en binnendringen, net als een actief virus. Hiervoor was de oriëntatie van de spike-eiwitten en de vorm van het pseudovirion de sleutel, en hier loonde Oh’s uitgebreide ervaring met het conjugeren van actieve eiwitten aan nanostructuren. Voordat ze verder gingen met de duurdere cellulaire leveringstests, moesten ze testen of hun pseudovirion buiten de cellen functioneerde door fluorescerende gouden nanodeeltjes te conjugeren met de ACE2-receptoren en door te monitoren op fluorescentie-uitdoving. Oh somt de meerdere verhoudingen op van proteïne tot quantumdot, quantumdotgroottes en oppervlaktechemie die ze probeerden voordat ze eindelijk fluorescentie-uitdoving op proteïnebinding konden waarnemen en klaar waren om het pseudovirion naar het team van Gorshkov te sturen ‘om coole dingen te doen met de echte cel.”

Om de interactie van pseudovirion met ACE2 in een echte cel te observeren, moest de kwantumpunt op het pseudovirion nu worden ontworpen om uit te zenden op een golflengte die gemakkelijk te onderscheiden was van het groen fluorescerende eiwit op ACE2, in tegenstelling tot het optimaliseren van het blussen van nanodeeltjes. Met de twee duidelijke signalen kon het team van NCATS de binding van de twee eiwitten en de daaropvolgende endocytose volgen. Bovendien konden ze zien dat de binding en endocytose werd voorkomen in de aanwezigheid van twee testantistoffen. Ze zouden zelfs het endocytosemechanisme kunnen testen, dat verloopt door middel van een eiwit genaamd dynamine. Toen ze Dyngo-4a toevoegden, dat dynamine onderbreekt, konden ze de binding zien plaatsvinden, maar geen daaropvolgende endocytose.

De resultaten zijn ook een succes voor onderzoekssamenwerkingen op afstand, aangezien de teams elkaar nooit hebben ontmoet. “Het soort samenwerking dat we hier hebben is zeldzaam”, zegt Gorshkov, die aangeeft hoeveel hun vorderingen sneller waren dan eerdere samenwerkingen waarbij er een groter aantal fysieke bijeenkomsten en gecoördineerde activiteiten waren geweest. “Er was zo’n drive en focus van beide groepen dat het echt heel goed synergetisch werkte.”

Het quantum dot-pseudovirion beperkt zich tot het afbeelden van celpenetratie door endocytose, en het moet nog worden bepaald of dit mechanisme van kracht wordt voor alle celtypen, in het bijzonder longweefsel. Een alternatief SARS-CoV-2-aanvalsmechanisme is gebaseerd op membraanfusie, en beeldvorming hiervan met het quantum-dot-pseudovirion zou aanzienlijke aanpassingen vereisen om meer als een membraan met de cel te interageren. De snelle doorvoer en directe waarnemingen die de quantum-dot pseudovirion mogelijk maakt, zouden echter aanzienlijke voordelen moeten opleveren bij het zoeken naar antilichamen.