Directe observatie van intracellulaire vorming van nanodeeltjes met nano-computertomografie

Het is momenteel een uitdaging om de vorming van intracellulaire nanostructuren in het laboratorium direct te observeren. In een nieuw rapport gebruikten Miaomiao Zhang en een onderzoeksteam in chemie, biowetenschappen, medische techniek en wetenschap en technologie in China een rationeel ontworpen kleine molecule, afgekort NBC-Iod-CBT (afkorting van 4-nitrobenzylcarbamaat-Cys (SEt ) -Asp-Asp-Phe (jodium) -2-cyano-benzothiazool) en direct waargenomen intracellulaire vorming van nanodeeltjes met nanocomputed tomografie (nano-CT).

Tijdens de experimenten, de glutathion (GSH) reductie en nitroreductase (NTR) splitsingsmechanismen zorgden ervoor dat NBC-Iod-CBT-moleculen een klik condensatiereactie en zelf-assembleren nanodeeltjes (NP’s) als Iod-CBT-NP’s. Toen het team nano-CT-beeldvorming uitvoerde van met NBC-Iod-CBT behandelde, nitroreductase-expressie HeLa-cellen in het laboratorium toonden ze het bestaan ​​van zelf-geassembleerde Iod-CBT-NP’s in hun cytoplasma aan. De nieuwe strategie is nu gepubliceerd op Science Advances en zal levenswetenschappers en bio-ingenieurs helpen de vormingsmechanismen van intracellulaire nanostructuren te begrijpen.

Een slimme strategie voor nanoassemblage

Het samenstellen van nanostructuren met behulp van kleine moleculaire voorlopers in cellen is een intelligente strategie met grote voordelen bij moleculaire beeldvorming en medicijnafgifte. Kleine moleculen kunnen gemakkelijk door cellen worden opgenomen, maar ze worden ook snel weer opgeruimd. Daarentegen hebben nanostructuren met therapeutische middelen een langere retentietijd in cellen met hogere potentie. Toch is het voor een cel veel moeilijker om een ​​nanostructuur op te nemen dan een klein molecuul. Wetenschappers activeren daarom nanostructuren voor cellulaire opname door het wijzigen van het celoppervlak met gerichte ‘kernkoppen’, maar dergelijke modificaties kunnen de reproduceerbaarheid van het nanocomplex verminderen. Als gevolg hiervan is een recent ontwikkeld slimme methode heeft tot doel intracellulaire nanodeeltjes te vormen, waarbij celkweken geïncubeerd met een kleine moleculaire precursor een nanostructuur in zich zullen hebben, voor opwindende toepassingen in moleculaire beeldvorming en medicijnafgifte. Het is echter nog steeds moeilijk om onderscheid te maken tussen de kunstmatig gevormde nanostructuren en intrinsieke cellulaire structuren. Om dit te bereiken, Zhang et al. eerst ontwierpen ze een jodium (jodium) -bevattende precursor van een klein molecuul, vervolgens onderwierpen ze de verbinding aan intracellulaire enzym-geïnstrueerde zelfassemblage om de nanodeeltjes van belang te vormen en gebruikten ze nano-CT (nanocomputed tomografie) om de intracellulaire nanodeeltjes te observeren.

Het experiment

De gejodeerde NBC-Iod-CBT kleine moleculaire structuur had een rationeel ontwerp dat uit vier delen bestond, waaronder

1. Een 4-nitrobenxylcarbamaat (NBC) -substraat om nitroreductase (NTR) af te breken,
2. Een latent cysteïne (Cys) -motief en 2-cyano-benzothiazool (CBT) structuren voor CBT-Cys klikcondensatiereacties,
3. Een gejodeerd gebied voor contrastverbetering door computertomografie, en
4. Twee hydrofiele asparaginezuurmotieven voor een goede oplosbaarheid in water onder fysiologische omstandigheden

s.

Toen de verbinding nitroreductase (NTR) -overexpressie binnenging hypoxische (zonder voldoende zuurstof) kankercellen, ondergingen ze zelfassemblage om nanodeeltjes (NP’s) te vormen die bekend staan ​​als Iod-CBT-NP’s. Om de nitroreductase- (NTR) -getriggerde nanodeeltjesvorming in het laboratorium te induceren, incubeerden de wetenschappers het kleine molecuul NBC-Iod-CBT met gebufferde zoutoplossingen en voegden ze de nitroreductase-oplossing toe gedurende twee uur om nanostructuren te vormen met zichtbare absorpties tussen 500-700 nm. .

Toen Zhang et al. een nitroreductaseremmer toegevoegd die bekend staat als dicoumarin aan de oplossing nam de zichtbare absorptie van de mengsels af, wat de vorming van nanostructuren in aanwezigheid van nitroreductase bevestigt. Gebruik makend van transmissie-elektronenmicroscopie afbeeldingen, observeerde het team het uiterlijk van nanodeeltjes en gebruikte ze hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) en hoge resolutie matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie massaspectrometrie om de vorming van Iod-CBT-NP’s te bevestigen. Zhang et al. daarna driedimensionale (3-D) nano-CT-beelden van het mengsel gebruikt met een zachte röntgenmicroscopie nano-CT om uiteindelijk de 3D-nano-CT-beelden te reconstrueren, waarbij verschillende bestanddelen van de verbinding verschillende röntgenfoto’s vertoonden absorptiemogelijkheden. Op deze manier vergemakkelijkte het experiment de NBC-Iod-CBT-verbinding van belang om NTR-getriggerde zelfassemblage te ondergaan om de verwachte nanodeeltjes (Iod-CBT-NP’s) in het laboratorium te vormen.

Intracellulaire vorming van Iod-CBT-NP’s en zachte röntgenmicroscopie nano-CT-beeldvorming

Zhang et al. onderzocht vervolgens hetzelfde experimentele proces om zelfassemblage van nanodeeltjes in cellen te induceren. De verbinding van belang (NBC-Iod-CBT) had een hogere selectiviteit voor nitroreductase, om daardoor mogelijke intracellulaire interferenties in de aanwezigheid van andere intracellulaire bestanddelen zoals biothiolen, oxidanten en aminozuren te voorkomen. De menselijke cervicale HeLa-kankercellen brengen doorgaans nitroreductase (NTR) tot overexpressie onder hypoxische omstandigheden (zonder voldoende zuurstof), waarbij de hoogste experimentele niveaus binnen acht uur worden bereikt. Toen Zhang et al. geïncubeerde hypoxische HeLa-cellen met het kleine molecuul NBC-Iod-CBT, observeerden ze de uiteindelijke vorming van nanodeeltjes in de hypoxische HeLa-cellen. Met behulp van elektronenmicroscopiebeelden van de cellen toonden ze het bestaan ​​van de nanodeeltjes aan zoals verwacht in het celcytoplasma.

Om de interessante nanodeeltjes (Iod-CBT-NP) in de cellen direct te observeren, behandelde het team experimenteel de hypoxische HeLa-cellen en beeldde ze ze af met behulp van zachte röntgenmicroscopie nano-CT. Vervolgens gebruikten ze hypoxische HeLa-cellen die waren voorbehandeld met dicoumarine of normoxia (normale zuurstofconcentraties) als twee positieve controles en onbehandelde hypoxie of normoxia HeLa-cellen als twee negatieve controles. De resultaten wezen op de vorming van de Iod-CBT-nanodeeltjes in het cytoplasma van hypoxische HeLa-cellen. Toen ze deze cellen aan een nitroreductaseremmerbehandeling onderwierpen, nam het CT-contrast van het cytoplasma af. Het team reconstrueerde 2D-projecties van de cellen om 3D-nanoCT-afbeeldingen te verkrijgen. Met behulp van de lineaire absorptiecoëfficiënt (LAC) of lineaire verzwakkingscoëfficiëntZhang et al. bevestigde de haalbaarheid van intracellulaire vorming van nanodeeltjes.

Outlook

Op deze manier ontwierpen Miaomiao Zhang en collega’s rationeel een gejodeerd NBC-Iod-CBT-construct met een klein molecuul om direct nanodeeltjes in cellen te vormen en te observeren met behulp van nano-CT. Na in vitro experimenten uit de eerste hand, voerde het team verdere studies uit in het cytoplasma van HeLa-cellen die nitroreductase tot expressie brengen. Met behulp van analytische technieken toonde het team de vorming van nanodeeltjes (Iod-CBT-NP) in de met NBC-Iod-CBT behandelde hypoxische HeLa-cellen met een klein molecuul. Ze verifieerden hun methode met behulp van de lineaire absorptiecoëfficiënt en bevestigden de haalbaarheid van intracellulaire vorming van nanodeeltjes. Dit werk zal onderzoekers helpen om diepere inzichten te verwerven in de vorming van intracellulaire nanostructuren met belangrijke toepassingen in nanogeneeskunde en bio-engineering.