Nanobody-steigers maken Cryo-EM-beeldvorming van de kleinste eiwitstructuur tot nu toe mogelijk

Een samenwerkingsteam van het Rosalind Franklin Institute, de Universiteit van Oxford en Diamond Light Source heeft een doorbraakmethode ontwikkeld die het mogelijk maakt om zeer kleine eiwitten in beeld te brengen met behulp van cryo-elektronenmicroscopie (CRYOO-EM). De resultaten worden gepubliceerd in Nature Chemical Biology.

Door nieuwe bifunctionele, bispecifieke nanobody -steigers te ontwerpen, hebben de onderzoekers een van de grootste uitdagingen in het veld overwonnen: eiwitten visualiseren van minder dan 50 kDa groot. Met behulp van deze benadering loste het team de structuur op van kippeneiwit lysozyme-bij slechts 14 kDa, het kleinste eiwit ooit opgelost door cryo-EM.

Deze vooruitgang is zeer belangrijk, omdat bijna 75% van de menselijke eiwitcoderende genen eiwitten produceren binnen dit kleine groottebereik. Veel van deze eiwitten zijn van cruciaal belang voor de celfunctie en spelen een belangrijke rol bij gezondheid en ziekte.

In de afgelopen jaren is cryo-EM-EM met één deeltjes een mainstream-methode geworden voor het bepalen van eiwitstructuren. Een van de belangrijkste voordelen van de techniek is de mogelijkheid om de moleculaire details van structuren in een nabije native staat te tonen.

Beeldvorming van kleine eiwitten is echter een uitdaging gebleven vanwege hun lage signaal-ruisverhouding, wat leidt tot problemen tijdens gegevensverwerking met deeltjesplukken en afstemming, en uiteindelijk historisch leidend tot reconstructies van lage resolutie.

De nieuwe nanobody -steiger overwint deze uitdagingen voor gegevensverwerking door de kleine eiwitten te binden aan de uiteinden van bifunctionele, bispecifieke nanobodieën, die de schijnbare grootte verhoogt en hen een duidelijke geometrie geeft.

“Dit is de grootste uitdaging die ik ooit heb aangegaan, en het is ook een waardevolle leerervaring geweest op mijn weg om een ​​onafhankelijke onderzoeker te worden. Deze nieuwe techniek heeft een enorm potentieel om een ​​universeel toepasselijk hulpmiddel te worden-niet alleen in structureel onderzoek, maar over vele andere gebieden, gereden door de bispecifieke capaciteiten,” zegt co-auteur Gangshun Yi, ebic postdoctoral onderzoeksassistent.

Dimitrios Mamalis, een gezamenlijke Ph.D. Student tussen de Universiteit van Oxford en de Franklin, legt uit hoe dit werk is begonnen: “Het begon als een experiment voor vrijdagmiddag, wat betekent dat het op dat moment niet de belangrijkste focus was van ons onderzoek, maar het is in een geweldig resultaat beland.

“Mingda Ye werkte oorspronkelijk aan gembodies voor kristallografie en toen vroegen we ons af of we deze methode konden overdragen om te cryo-EM als we de gembodies in oplossing konden conjugeren. Dit was toen ik de methode begon te vinden en de reacties en voorwaarden te optimaliseren, met een gangstshun yi om de structuren op te lossen.”

In tegenstelling tot veel vergelijkbare benaderingen is de methode modulair en vereist geen moeizame re-optimalisatie voor elk nieuw eiwitdoel. Hiermee kunnen ook twee eiwitten tegelijkertijd worden bestudeerd, zelfs als ze van verschillende maten zijn, door ze aan tegenovergestelde uiteinden van de steiger te bevestigen.

Professor Ben Davis, wetenschapsdirecteur aan de Franklin en co-auteur van de studie, benadrukte de kracht van dit samenwerkingswerk: “Dit was een prachtige, organische samenwerking die voortkwam uit parallellen tussen kristallisatie en covalent vangen van eiwitten in oplossing. De sidechain-to-sidechain-conjugatie werkte opmerkelijk goed, en de efficiëntie van de methode is strikte. Het is een spannende en pragmatische nieuwe manier om te bestuderen.”