Ontwikkeling van een nieuw kleurenpalet voor beeldvorming met één molecuul

Onderzoekers bestuderen vaak biomoleculen zoals eiwitten of aminozuren door ze chemisch te binden “fluorofoor,” een gevoelig molecuul dat energie uit licht absorbeert en opnieuw uitzendt.

Wanneer geactiveerd door een laser en afgebeeld door een krachtige microscoop, exploderen deze fluorofoortags of -labels in een regenboog van kleur en informatie. Ze bieden een schat aan inzichten die bijvoorbeeld kunnen helpen bij het opsporen van ziekten of het identificeren van genetische aandoeningen.

Om meer dan één type molecuul tegelijk te detecteren, of “multiplex” Bij metingen worden aanvullende soorten fluoroforen gebruikt die verschillende kleuren licht uitstralen. Maar het is verrassend moeilijk om verschillende kleuren van elkaar te onderscheiden op het niveau van één molecuul. Dit is de reden waarom de meeste microscopen slechts naar drie tot vier kleuren kijken.

Onderzoekers kunnen deze kleurenbarrière doorbreken met behulp van geavanceerde technieken die dagenlange etiketterings- en beeldvormingsrondes met zich meebrengen, of ingewikkelde opstellingen met veel lasers gebruiken. Het vinden van een eenvoudige en snelle manier om veel kleuren te zien, blijft echter een grote uitdaging.

Onderzoekers van de UChicago Pritzker School of Molecular Engineering hebben een nieuwe oplossing voor deze uitdaging, beschreven in een artikel gepubliceerd vandaag in Natuur Nanotechnologie. Een nieuwe techniek, beschreven door het Squires Lab, maakt gebruik van drie eenvoudige chemische bouwstenen om er tientallen te ontwikkelen “FRETfluor” tags, waardoor een mooier, genuanceerd kleurenspectrum ontstaat dat onderzoekers kunnen gebruiken om biomoleculen te labelen.

“Onze aanpak is eenvoudiger. Het is één shot van labeling, één shot van beeldvorming,” zei co-eerste auteur Jiachong Chu, een UChicago Pritzker Molecular Engineering Ph.D. kandidaat. “Dat betekent dat u meer kunt doen met minder. Momenteel is onze nieuwe techniek de beste op dit gebied.”

Een nieuwe weg naar multiplexing

Individuele moleculen zijn klein en celmonsters zijn relatief groot, ingewikkeld en rommelig. Het uiteindelijke doel van dit onderzoeksgebied – een doel dat in de paper van het PME-team dichterbij dan ooit werd gebracht – is multiplexing.

“Het multiplexen van monsters betekent dat je in dezelfde meting meer dan één soort molecuul kunt meten, dus misschien heb je 10 of 50, of honderden verschillende eiwitten die je wilt identificeren.” zei Neubauer Family Assistant Professor of Molecular Engineering Allison Squires. “Met deze nieuwe techniek kunnen we er tientallen doen. Ik denk dat we dat kunnen uitbreiden naar honderden.”

Om deze uitdaging aan te gaan, heeft het Squires Lab-team een ​​innovatieve nieuwe manier gevonden om een ​​gevestigde techniek te gebruiken: Förster Resonance Energy Transfer of FRET. FRET is een mechanisme dat beschrijft hoe energie wordt overgedragen tussen lichtgevoelige moleculen. Het is een manier voor onderzoekers om de afstand tussen verschillende delen van een molecuul te meten, of om te rapporteren wanneer twee moleculen op elkaar inwerken. FRET-signalen zijn uitzonderlijk gevoelig voor de eigenschappen van de deelnemende fluoroforen, die het UChicago-team gebruikte om hun FRETfluor-labels af te stemmen.

“Dit project maakt gebruik van FRET op een nieuwe manier,” zei co-eerste auteur Ayesha Ejaz, een Ph.D. kandidaat scheikunde. “FRET wordt vaak gebruikt voor het meten van afstanden en het observeren van de dynamiek in biomoleculen. We hebben de afstand tussen een donor- en acceptorkleurstof gewijzigd om verschillende FRET-efficiënties en andere eigenschappen te creëren die we gebruiken om de verschillende constructen te identificeren.”

De 27 tags die in het onderzoek van het PME-team werden gebruikt, waren 27 “FRETfluors” ze ontwierpen met behulp van een eenvoudige combinatie van DNA, een groene cyaninekleurstof (Cy3) en een rode cyaninekleurstof (Cy5). Naast dat ze in verschillende kleuren gloeien, vertonen FRETfluors elk andere afstembare eigenschappen, zoals de timing van hoe fotonen worden uitgezonden, of wat de oriëntaties van deze fotonen zijn.

Samen kunnen deze eigenschappen worden gebruikt om een ​​FRETfluor in slechts een fractie van een seconde te identificeren, bij ultralage concentraties. Ejaz zei dat een mogelijke toekomstige richting voor dit onderzoek is om uiteindelijk gewone fluorofoortags te vervangen door deze FRETfluors.

“Als mensen naar meerdere dingen tegelijk willen kijken, zoals verschillende delen van een cel, labelen ze meestal elk onderdeel met een ander fluorescerend label dat een bepaalde kleur licht uitstraalt. Maar fluorescerende tags zijn beperkt tot vier of vijf kleuren,” zei Ejaz.

“Als in plaats daarvan FRETfluors kunnen worden gebruikt, kunnen we het aantal ‘kleuren’ dat beschikbaar is voor fluorescentiemicroscopie vergroten. We testen momenteel hoe goed de FRETfluors werken in verschillende soorten experimenten en omgevingen, wat ons een beter inzicht zal geven in alle mogelijkheden.”

“Ik ben opgewonden om de FRETfluors in actie te zien,” ze zei.

Gevoeligheid en eenvoud

Voor Squires komt een groot deel van de aantrekkingskracht van de nieuwe multiplextechniek voort uit gevoeligheid gecombineerd met eenvoud.

“Iedereen wil zijn of haar favoriete test multiplexen, en er zijn veel bestaande strategieën die in bepaalde situaties zullen werken.” ze zei. “Er zijn technieken die goed werken als je heel veel tijd hebt, of als je monster dood is, zodat er niets beweegt.

“We vallen het probleem aan waar je niet veel tijd hebt. Je wilt weten welke ziekte iemand heeft terwijl er nog tijd is om die te bestrijden, of je hebt maar een heel klein stukje monster en je krijgt één kans om elk molecuul te identificeren terwijl het door je kanaal stroomt. We kunnen FRETfluors in een fractie van een seconde identificeren tot tientallen femtomolaire concentraties.”

Eenvoud is de sleutel, zowel door gewone chemicaliën te gebruiken om de FRETfluors te maken als door te pionieren met een techniek waarbij slechts één laser nodig is voor het uitlezen.

“We labelen slechts één keer om te targeten en doen de uitlezing slechts één keer,” zei Chu. “In die context kunnen we 27 verschillende tags maken die tegelijkertijd kunnen worden gebruikt.”

Squires beschreef hoe bestaande technieken samen met FRETfluors konden worden gebruikt voor meer multiplexwinst:”je zou mooie laser-excitatieschema’s kunnen introduceren of andere fluoroforen kunnen gebruiken die enigszins andere eigenschappen hebben”—dat zou de uitlezingen van bestaande labels verbeteren.

Het toepassen van deze vermenigvuldigers op hun nieuwe, krachtigere techniek kan volgens Squires werelden van nieuw onderzoek en nieuwe toepassingen openen.

“Deze verbeteringen aan beeldvorming en op flow gebaseerde biomedische tests zullen de volgende generatie innovatie mogelijk maken,” zei Squires.