Snelle zuivering en karakterisering van circulerende kleine extracellulaire blaasjes op een labelvrij lab-on-a-chip

Alle cellen scheiden nanoschaal uit extracellulaire blaasjes natuurlijk als door lipiden dubbellaags begrensde deeltjes. Daarom zijn het geldige biomarkers om een ​​verscheidenheid aan ziekten te identificeren.

Het is belangrijk om kleine extracellulaire blaasjes efficiënt te isoleren met behoud van de opbrengst en zuiverheid om hun potentieel in diagnostische, prognostische en therapeutische toepassingen te onderzoeken.

Conventionele isolatiemethoden hebben tekortkomingen, waaronder een lage zuiverheid en opbrengst, langdurige extractieprocedures, gespecialiseerde apparatuur en hoge kosten.

In een onderzoek gepubliceerd in Wetenschappelijke rapportenManju Sharma en een team van wetenschappers in biomedische technologie aan de Universiteit van Cincinnati, Ohio, VS, ontwikkelden een nieuw op isolator gebaseerd diëlektroforetisch apparaat om snel kleine extracellulaire blaasjes te isoleren uit biovloeistoffen en celcultuurmedia, op basis van hun diëlektrische eigenschappen.

De wetenschappers karakteriseerden met behulp van het instrument de kleine extracellulaire blaasjes geïsoleerd uit de biovloeistoffen van kankerpatiënten en voerden een drievoudige karakterisering uit met conventionele flowcytometriegeavanceerde beeldvormende flowcytometrie, en microRNA-sequencing om een ​​hoge opbrengst aan zuivere extracellulaire blaasjes te verkrijgen. Het platform is efficiënt in het snel isoleren van biomarkers en het behouden van de biomoleculaire integriteit van de blaasjes.

In membraan ingekapselde biologische vaten

Biologisch gezien zijn kleine extracellulaire blaasjes membraan-ingekapselde biologische vaten die worden aangetroffen in biovloeistoffen zoals bloedurine, speekselsperma, moedermelk En hersenvocht; vrijgegeven door cellen in de extracellulaire ruimte.

Dergelijke blaasjes op nanoschaal kunnen hun biomoleculaire lading horizontaal overbrengen om te functioneren als intercellulaire signaalvectoren. Dergelijke extracellulaire blaasjes zorgen vanwege hun hoge mate van gevoeligheid en specificiteit uitstekende stabiliteit. Hun vroege detectie in vloeibare biopsieën kan de detectie van kankerinfecties en neurodegeneratieve, en stofwisselingsziekten.

De isolatie van de blaasjes is echter een uitdaging vanwege hun nanoschaalgrootte fysisch-chemische eigenschappen. Isolatiemethoden zijn doorgaans afhankelijk van de eigenschappen van de extracellulaire blaasjes, en hoewel dergelijke apparaten veelbelovende eigenschappen hebben, zijn de fabricagekosten, de verdunning van het monster en de gevoeligheid voor verstopping inherente uitdagingen.

Als reactie daarop ontwikkelden Sharma en collega’s een klasse nieuwe, op isolator gebaseerde diëlektroforetische benaderingen met micropilaren in microfluïdische kanalen om nanodeeltjes snel te overspoelen op basis van hun grootte en unieke diëlektrische eigenschappen.

Werkingsmechanisme

Het apparaat beschikte over een reeks micropipetten die in staat zijn nanodeeltjes te isoleren uit kleine monstervolumes door een aanzienlijk laag elektrisch veld aan te leggen over het hele oppervlak. lengte van de pipetten. De architectuur van de poriëngeometrie maakte de isolatie mogelijk van extracellulaire blaasjes uit kleine monstervolumes van geconditioneerde celkweekmedia, en biovloeistoffen van gezonde donoren.

In dit werk isoleerden Sharma en team de biovloeistoffen van kankerpatiënten, waaronder serum, plasma en urine, gevolgd door multiparametrische karakterisering via flowcytometrie en de volgende generatie miRNA-sequencing.

Het team zuiverde kleine extracellulaire blaasjes uit serum, plasma en urine in fosfaatgebufferde zoutoplossing met behulp van de op isolator gebaseerde diëlektroforetische benadering. Sharma en collega’s gebruikten transmissie-elektronenmicroscopie om de aanwezigheid van de blaasjes te bevestigen, en multiparametrische analyse van gezuiverde circulerende kleine extracellulaire blaasjes via flowcytometrie onderzocht.

Het team isoleerde de blaasjes en analyseerde ze, gevolgd door conventionele flowcytometriestudies. De onderzoekers toonden verder de capaciteit en het gebruik van het apparaat aan door de isolaten te karakteriseren ImageStream-software.

Na miRNA-sequencing heeft het team 137 verschillende, volwassen miRNA-transcripten in kaart gebracht aan het menselijk genoom in verschillende monsters om het apparaat in miRNA op te nemen. workflows voor biomarkeranalyse. Ze voerden transcriptomische profielen uit en voerden hoofdcomponentenanalyse uit.

Vooruitzichten

Op deze manier toonden Manju Sharma en collega’s de capaciteit en efficiëntie aan van een laagspannings, labelvrij isolatorgebaseerd diëlektroforetisch apparaat om kleine extracellulaire blaasjes te isoleren uit serum, plasma en urine van kankerpatiënten door middel van submicrondeeltjesdetectie. multiparametrische karakterisering met behulp van conventionele flowcytometrie en geavanceerde flowcytometriemethoden.

De RNA-concentraties van het werk waren vergelijkbaar met eerdere werken en bevestigden dat de isolatiemethode een haalbaar alternatief was voor de methoden die al in het laboratorium waren vastgesteld. De analytische methoden kunnen nuttig zijn als platforms voor vloeibare biopsie om kleine extracellulaire blaasjes te isoleren, en om op extracellulaire blaasjes gebaseerde diagnostische en monitoringplatforms te ontwikkelen.