Nieuwe single-cell nanopore sequencing tool versnelt de analyse van tumorcellen

Onderzoekers van Northwestern Medicine onder leiding van Ruli Gao, Ph.D., assistent-professor Biochemie en Moleculaire Genetica, hebben een nieuw hulpmiddel voor genetische sequentiebepaling ontwikkeld dat de sequentieanalyse van genotypes en fenotypes van dezelfde cel in tumoren versnelt, zoals beschreven in een studie gepubliceerd in Natuurcommunicatie.

Single-cell nanopore RNA-sequencing is een nieuwer type genetische sequencing die de huidige high-throughput single-cell RNA-sequencing-technieken naar voren duwt van next-generation sequencing (NGS), die alleen korte strengen van RNA’s kan sequensen, naar lang gelezen derde- generation sequencing (TGS), die direct de volledige lengte van RNA’s kan meten.

Het is echter ook bekend dat de geavanceerde techniek hoge sequentiëringsfouten veroorzaakt en ook afhankelijk is van short-reads sequencing – het genereren van overeenkomende NGS-gegevens om de identificatie van mobiele gegevens te begeleiden – of op het gebruik van een witte lijst met streepjescodes om de gegevens op te splitsen in echte cellen en enkele moleculen.

“Deze techniek is gebaseerd op celstreepjescodes en streepjescodes van één molecuul, wat we unieke molecuulidentificaties noemen, om een ​​hoge doorvoer te bereiken, dus je ziet de uitdagingen als gevolg van hogere sequentiefouten in streepjescodereeksen. De momenteel beschikbare methoden zijn afhankelijk van gegevens van de volgende generatie of zijn afhankelijk van een theoretische witte lijst om te herkennen welke echte celbarcodes en unieke molecuul-identificaties zijn, “zei Gao, die ook lid is van het Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center van Northwestern University.

Om dit proces te verbeteren, ontwikkelde het team van Gao scNanoGPS (single-cell Nanopore sequencing analysis of Genotypes and Phenotypes Simultaneously), een nieuwe sequencing-tool die volledig onafhankelijke deconvolutie uitvoert van foutgevoelige long-reads in enkele cellen en enkele moleculen.

“Om de toepassingen van nieuwe technologie in genomics-onderzoek verder te vergemakkelijken, construeert scNanoGPS aanvullende functionele modules om zowel genotypen (mutaties) als fenotypes (gen- en isovormexpressies) in individuele cellen te berekenen op basis van high-throughput single-cell nanopore RNA-sequencinggegevens, ” zei Cheng-Kai Shiau, Ph.D., een postdoctoraal onderzoeker in het Gao-laboratorium en co-eerste auteur van de studie.

scNanoGPS verhoogt de sequencing-doorvoer van honderden naar duizenden cellen, wat vergelijkbaar is met de huidige wijdverspreide op short-reads gebaseerde eencellige RNA-sequencingtechnieken, en de expressieprofielen tussen short-read en long-read data zijn zeer concordant, volgens Gao.

“Vanwege de dekking van het hele genlichaam, maken lang gelezen gegevens berekeningen mogelijk van het splitsen van isovormen en genetische veranderingen die grotendeels worden gemist door kort gelezen eencellige RNA-sequencing, ” zei Gao.

Om hun tool te valideren, gebruikte het team van Gao scNanoGPS om niertumorcellen en lymfocyten te sequensen, waarbij werd vastgesteld dat de cellen celtypespecifieke combinaties van isovormen en genetische mutaties tot expressie brengen.

“We vonden celtypespecifieke isovormen, waaronder zowel tumorcelspecifieke isovormen als immuuncelspecifieke isovormen, en toonden ook celtypespecifieke mutatieprofielen binnen dezelfde tumoren aan”, zegt Lina Lu, Ph.D., een postdoctoraal onderzoeker in de Gao-laboratorium en co-eerste auteur van de studie.

“Het is bekend dat alternatieve splicing-isovormen een cruciaal post-transcriptiemechanisme zijn om de eiwitcomplexiteit in menselijke cellen te vergroten. We zijn verheugd te zien dat scNanoGPS de directe meting van splicing-isovormen op eencellig niveau mogelijk maakt, ” zei Gao.

Wat toekomstige toepassingen betreft, hoopt Gao dat scNanoGPS kan worden gebruikt om celtypespecifieke isovormen te identificeren die bijdragen aan diverse ziekten bij de mens, zoals kanker, hartfalen en zelfs afstoting van orgaantransplantaties.

“Nieuwe technologieën maken het genereren van gegevens relatief eenvoudiger, maar onderzoekers kunnen nieuwe datatypes niet effectief gebruiken zonder een robuuste rekentool. scNanoGPS vult een leemte tussen de technologieën en toepassingen. We hopen de krachtige, lang gelezen single-cell sequencing-technologie beschikbaar en toegankelijk te maken naar alle algemene laboratoria,” zei Gao.