Beeldvorming met hogere resolutie van levende, bewegende cellen met behulp van plasmonische metasurfaces

In de zoektocht om buitengewoon kleine structuren en verschijnselen met een hogere precisie in beeld te brengen, hebben wetenschappers de grenzen van de optische microscoopresolutie verlegd, maar deze vooruitgang gaat vaak met grotere complicaties en kosten gepaard.

Nu hebben onderzoekers in Japan aangetoond dat een glazen oppervlak ingebed met zelf-geassembleerde gouden nanodeeltjes de resolutie kan verbeteren met weinig extra kosten, zelfs met behulp van een conventionele breedveldmicroscoop, waardoor fluorescentiemicroscopie met hoge resolutie in staat is om levende cellen met hoge snelheid in beeld te brengen.

Omdat optische microscopen licht vergroten om gedetailleerde beelden van een structuur te verkrijgen, is de grootte van te onderscheiden objecten lange tijd beperkt geweest door diffractie – een eigenschap van licht dat ervoor zorgt dat het zich verspreidt wanneer het door een opening gaat.

Onderzoekers hebben technieken ontwikkeld om deze limieten te overbruggen met zeer geavanceerde optische systemen, maar veel daarvan zijn afhankelijk van het gebruik van sterke lasers, die levende cellen kunnen beschadigen of zelfs doden, en van het scannen van het monster of het verwerken van meerdere beelden, waardoor echte -time beeldvorming.

“Recente technieken kunnen verbluffende beelden opleveren, maar veel daarvan vereisen zeer gespecialiseerde apparatuur en zijn niet in staat de beweging van levende cellen te observeren”, zegt Kaoru Tamada, een vooraanstaand professor aan het Institute for Materials Chemistry and Engineering van Kyushu University.

Door cellen af ​​te beelden met behulp van real-time fluorescentiemicroscopiemethoden, ontdekten Tamada en haar groep dat ze de resolutie onder een conventionele breedveldmicroscoop konden verbeteren tot bijna de diffractielimiet door het oppervlak onder de cellen te veranderen.

Bij fluorescentiemicroscopie worden celstructuren van belang gelabeld met moleculen die energie van binnenkomend licht absorberen en, door het proces van fluorescentie, opnieuw uitzenden als licht van een andere kleur, dat wordt verzameld om het beeld te vormen.

Hoewel cellen meestal op gewoon glas worden afgebeeld, bedekte de groep van Tamada het glasoppervlak met een zelf-geassembleerde laag van gouden nanodeeltjes bedekt met een dunne laag siliciumdioxide, waardoor een zogenaamd meta-oppervlak met speciale optische eigenschappen ontstond.

Met een diameter van slechts 12 nm vertonen de georganiseerde metalen nanodeeltjes een fenomeen dat bekend staat als gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie, waardoor het metasurface energie kan verzamelen van nabijgelegen lichtemitterende moleculen voor zeer efficiënte heruitzending, waardoor een verbeterde emissie wordt geproduceerd die beperkt blijft tot de 10 nm. dik nanodeeltjesoppervlak.

“Door de nanodeeltjes te introduceren, hebben we effectief een lichtgevend vlak gecreëerd dat slechts enkele nanometers dik is”, legt Tamada uit. “Omdat het licht van interesse uit zo’n dun laagje komt, kunnen we er beter op focussen.”

Bijkomende voordelen komen voort uit de snelle energieoverdracht naar het metasurface, het verder lokaliseren van emissiepunten door diffusie te verminderen, en de hoge brekingsindex van het metasurface, die helpt om de resolutie te verbeteren volgens de diffractielimiet van Abbe.

Met behulp van het metasurface maakten de onderzoekers beelden in realtime muiscellen die bekend staan ​​als 3T3-fibroblasten die genetisch zijn gemanipuleerd om een ​​eiwit te produceren dat paxilline wordt genoemd en dat wordt gemodificeerd om groen licht uit te stralen wanneer het wordt opgewonden. Paxilline speelt een sleutelrol bij het creëren van focale adhesies – punten waar moleculen in het celmembraan interageren met de buitenwereld.

Door het hele monster te verlichten met laserlicht loodrecht op het oppervlak, konden de onderzoekers veranderingen in paxilline nabij het celmembraan met een hogere resolutie in beeld brengen met behulp van het metasurface in plaats van glas.

Door het verlichtingslicht te kantelen om totale interne reflectie te bereiken, konden de onderzoekers beelden verkrijgen met een nog hoger contrast omdat het meeste van het verlichtingslicht van het oppervlak wordt gereflecteerd terwijl slechts een kleine hoeveelheid de celzijde bereikt, waardoor de strooimissie die wordt geproduceerd door verlichting die diep in de cel.

Analyse van beelden die elke 500 milliseconden werden opgenomen met een digitale camera met superresolutie, bracht duidelijke verschillen in intensiteit aan het licht over vlekken die slechts enkele pixels beslaan, wat aangeeft dat de resolutie ongeveer 200 nm was – dichtbij de diffractielimiet.

Cellen konden ook langer op het metasurface worden afgebeeld omdat de emissie ondanks een lagere inputenergie werd verbeterd, waardoor celbeschadiging na verloop van tijd werd verminderd.

“Metasurfaces zijn een veelbelovende optie voor het verbeteren van de resolutie voor onderzoekers over de hele wereld die conventionele optische microscopen gebruiken die ze al hebben”, zegt Tamada.

Naast het continu verbeteren van de oppervlakken voor gebruik met conventionele microscopen, onderzoeken de onderzoekers ook de voordelen die ze kunnen hebben voor meer geavanceerde microscoopsystemen.