Microscopiemethode verbreekt barrières bij chemische beeldvorming op nanoschaal

De superresolutiemicroscopen van vandaag hebben het mogelijk gemaakt om de wereld op nanoschaal met ongekende details te observeren. Ze vereisen echter fluorescerende tags, die structurele details onthullen, maar weinig chemische informatie bieden over de bestudeerde monsters.

Dit nadeel heeft de ontwikkeling van trillingsbeeldvormingstechnieken aangedreven, die moleculen kunnen identificeren op basis van hun unieke chemische bindingen zonder het monster te veranderen. Deze methoden detecteren fysieke veranderingen in monsters wanneer ze midden-infrarood (miR) licht absorberen, zoals verschuivingen in brekingsindex veroorzaakt door warmteabsorptie of door temperatuur geïnduceerde akoestische signalen. En toch worstelen bestaande methoden vaak met zwakke signaalniveaus, waardoor het moeilijk is om zowel hoge resolutie te bereiken (hoe fijn details kunnen worden gezien) als sterk chemisch contrast (hoe goed moleculen kunnen worden onderscheiden).

Als gemeld in Geavanceerde fotonicaeen nieuw ontwikkelde techniek, gestructureerde verlichting midfrarood fotothermische microscopie (SIMIP), behandelt nu deze beperking met een twee keer betere resolutie dan conventionele microscopie.

De nieuwe techniek is ontwikkeld door onderzoekers van de Universiteit van Zhejiang, China, geleid door prof. Delong Zhang.

Zhang merkt op: “SIMIP-microscopie integreert de principes van gestructureerde verlichtingsmicroscopie met middeninfrarood-fotothermische detectie. Midden-infrarood fotodetectie biedt chemische specificiteit, terwijl gestructureerde verlichtingsmicroscopie de ruimtelijke resolutie van het monster verbetert.”

Het systeem bestaat uit een kwantumcascade -laser (QCL) die specifieke moleculaire bindingen opwindt, waardoor gelokaliseerde verwarming wordt veroorzaakt die de helderheid van aangrenzende fluorescerende moleculen vermindert. Tegelijkertijd genereert een SIM-systeem bestaande uit een 488-nm continu-golf laser en een ruimtelijke lichtmodulator (SLM) gestreepte lichtpatronen die op verschillende hoeken op het monster worden geprojecteerd.

Deze patronen creëren moiré-franjes, coderen voor voorheen niet-oplosbare hoogfrequente details in detecteerbare laagfrequente signalen die worden vastgelegd door een wetenschappelijke CMOS (SCMOS) -camera. Door afbeeldingen te vergelijken met en zonder trillingsabsorptie, reconstrueert SIMIP afbeeldingen met hoge resolutie die rijk zijn aan zowel chemische als ruimtelijke informatie.

Het team paste Hessian SIM- en schaarse deconvolutie -algoritmen toe om een ​​hogere ruimtelijke resolutie te bereiken, tot ∼60 nm, met een beeldvormingssnelheid van meer dan 24 frames per seconde, wat conventionele miR -fotothermische beeldvorming overtreft.

Om de nauwkeurigheid van SIMIP te valideren, testten onderzoekers het op 200-nm polymethylmethacrylaatparels ingebed met thermosensitieve fluorescerende kleurstoffen. Door de QCL over de 1.420–1.778 cm te vegen^-1 Bereik, SIMIP heeft de vibratiespectra met succes gereconstrueerd, die nauw overeenkomt met de resultaten van Fourier Transform Infrared (FTIR) spectroscopie.

In termen van resolutie bereikte SIMIP een 1,5-voudige verbetering ten opzichte van conventionele miR-fotothermische beeldvorming, met een volledige breedte bij half maximum (FWHM) van 335 nm versus 444 nm in standaardmethoden. Bovendien was het in staat om onderscheid te maken tussen polystyreen en polymethylmethacrylaatparels in subdiffractieaggregaten, wat onmogelijk was met standaard fluorescentiemicroscopie.

Een bijkomend voordeel van SIMIP is het vermogen om autofluorescentie te detecteren – de natuurlijke fluorescentie uitgestoten door bepaalde biologische moleculen. Dit kan worden bereikt door over te schakelen van Widefield SIM naar point-scanning SIM voor gestructureerde excitatie van autofluorescentie of door een sondestraal van een kortere golflengte te gebruiken voor een breedfield-fotothermische detectiemethode om de compatibiliteit met bestaande optische instellingen te verbeteren.

Door SIM te integreren met MIP, bereikt SIMIP een snelle chemische beeldvorming van superresolutie buiten de diffractielimiet. Deze methode opent nieuwe mogelijkheden voor observaties in materiaalwetenschap, biomedisch onderzoek en chemische analyse. De onderzoekers stellen bijvoorbeeld voor om SIMIP te gebruiken om metabolieten met kleine moleculen te detecteren en hun interacties met cellulaire structuren te analyseren.

Het team is nu van plan de tijdelijke synchronisatie van Simip te verbeteren om de beeldvormingssnelheid en nauwkeurigheid verder te verbeteren, en temperatuurgevoelige kleurstoffen te verkennen om de gevoeligheid te vergroten. Met minimale hardware -aanpassingen in bestaande SIM -systemen is Simip klaar voor adoptie in laboratoria wereldwijd.