Onderzoekers ontwikkelen een efficiënt en toegankelijk platform met één molecuul voor het detecteren van verschillende amylinesoorten

Een onderzoeksteam onder leiding van de Hong Kong University of Science and Technology (HKUST) heeft een optisch plasmonische pincetgestuurd Surface-Enhanced Raman Spectroscopie (SERS)-platform ontwikkeld dat gebruik maakt van aan-en-uit controle van licht om verschillende amylinesoorten in mengsels te onderzoeken op het niveau van één molecuul, waarbij de heterogene structuren van pH-afhankelijke amylinesoorten worden onthuld, en de geheimen achter amyloïde aggregatiemechanismen geassocieerd met type 2 diabetes.

Door ensemblemiddeling te verwijderen, onderscheiden technieken met één molecuul het signaal van individuele moleculen om verborgen details te onthullen en een revolutie teweeg te brengen in ons begrip van complexe en heterogene moleculaire systemen. De huidige benaderingen met één molecuul zijn beperkt tot ultraverdunning en/of moleculaire immobilisatie, omdat het door diffractie beperkte detectievolume niet verder kan worden verminderd.

Terwijl bepaalde biomoleculen verschillende interacties aangaan die aanzienlijk worden beïnvloed door concentraties. Als een typisch intrinsiek ongeordend eiwit mist het menselijke Islet Amyloid Polypeptide (amyline, hIAPP) bijvoorbeeld stabiele secundaire structuren, maar bezit het de neiging tot aggregatie, bepaald door omgevingsfactoren, zoals concentratie en pH, om verschillende oligomere tussenproducten en amyloïde fibrillen te vormen bij type II diabetes. patiënten.

Het moleculaire mechanisme blijft onduidelijk vanwege de uitdagingen bij het detecteren van de zeldzame, voorbijgaande en heterogene amylinesoorten in een dynamisch mengsel, wat vraagt ​​om de ontwikkeling van geavanceerde methoden met één molecuul.

In een recente doorbraak heeft het onderzoeksteam onder leiding van prof. Huang Jinqing, assistent-professor bij de afdeling scheikunde van HKUST, met succes een nieuw platform met één molecuul ontwikkeld dat optische plasmonische manipulatie en SERS-meting combineert om het detectievolume te verminderen en de signaalverbetering te verbeteren, waardoor efficiënte en karakterisering van één molecuul met hoge doorvoer om pH-afhankelijke amylinesoorten bij fysiologische concentraties te bestuderen.

Concreet construeerde het team een ​​plasmonische verbinding tussen twee met Ag-nanodeeltjes gecoate silica-microkralen om een ​​extra Ag-nanodeeltje op te vangen en zo een dynamische nanoholte te vormen bij laserbestraling, die een enkele of enkele moleculen zou kunnen inkapselen voor gevoelige SERS-karakteriseringen.

Omdat zowel optische plasmonische trapping als SERS-verschijnselen ruimtelijk beperkt zijn tot de nanometerschaal, overschrijdt het de optische diffractielimiet om nauwkeurige positiecontrole mogelijk te maken, het detectievolume te minimaliseren en tegelijkertijd de SERS-verbetering te vergroten.

Bovendien zijn de geconstrueerde met Ag-nanodeeltjes beklede silica-microkralendimeren stabieler dan de conventionele Ag-nanodeeltjes die in oplossingen worden geassembleerd, waardoor het gemakkelijker wordt om de plasmonische junctie op gewone microscopen te observeren en te lokaliseren om de efficiëntie en reproduceerbaarheid te verbeteren. Door het laserlicht tussen de “aan” en “uit” toestand te schakelen, kunnen de onderzoekers de optische plasmonische vangst controleren om de montage en demontage van de dynamische nanoholte te moduleren voor bemonstering met hoge doorvoer en gelijktijdige SERS-metingen.

Met behulp van dit efficiënte platform met één molecuul heeft het onderzoeksteam een ​​statistisch significante hoeveelheid SERS-spectra benut die ten grondslag liggen aan de structurele kenmerken van verschillende amylinesoorten onder twee verschillende fysiologische omstandigheden: de secretoire korrels van β-cellen van de pancreas bij pH 5,5 en de extracellulaire compartimenten bij pH 7,4 respectievelijk.

Twee soorten laagbevolkte amylinesoorten werden geïdentificeerd op basis van hun overheersende monomeren in het vroege stadium van amyloïdeaggregatie bij neutrale pH, met een kritische bochtstructuur of een korte β-haarspeld met beperkte C-terminal, zoals ondersteund door moleculaire dynamica (MD) simulaties .

Een dergelijke kleine verschuiving in het evenwicht tussen verschillende amylinesoorten zou onomkeerbare amyloïdeontwikkeling kunnen veroorzaken, zelfs na aanpassing van de pH van 7,4 naar 5,5. De directe structurele karakterisering van deze amylinesoorten in heterogene mengsels geeft dus de impact van de pH op hun intra- en intermoleculaire interacties aan en werpt licht op het mechanisme achter pH-gereguleerde amyloïdeaggregatie voor het begrijpen van type 2 diabetes.

“We presenteren een eenvoudig te gebruiken strategie die het detectievolume vermindert, het moleculaire signaal verbetert en de omzetefficiëntie verhoogt”, legt prof. Huang uit. “Ons platform met één molecuul kan een grote hoeveelheid SERS-spectra verwerven als moleculaire snapshots, vergelijkbaar met die verkregen via MD-simulaties. Door de structurele details op het niveau van één molecuul statistisch te analyseren, zijn we in staat de bulkeigenschappen te reconstrueren en unieke resultaten te verkrijgen inzichten in de populatie en waarschijnlijkheid van specifieke molecuultypen binnen het heterogene mengsel. Het heeft het potentieel om verborgen mysteries in complexe systemen bloot te leggen.”

Het onderzoek is onlangs gepubliceerd in Natuurcommunicatie.