De kracht van nanoporiën ontsluiten: nieuwe ontwerpbenadering vergroot mogelijkheden voor analyse van afzonderlijke moleculen

Transmembraan β-barrel poriën (TMB’s) worden uitgebreid gebruikt voor single-molecule DNA en RNA sequencing. Ze maken de miniaturisatie mogelijk van een breed scala aan sensing en sequencing toepassingen in draagbare USB-formaat apparaten en point-of-care technologieën. Een team van Belgische en Amerikaanse onderzoekers heeft nu een algemene aanpak beschreven voor het ontwerpen van TMB poriën vanaf nul met aangepaste vormen en eigenschappen, wat nieuwe mogelijkheden opent voor single-molecule analytics. Hun resultaten waren gepubliceerd in Wetenschap.

Proteïne nanoporiën zijn de heilige graal in het veld van analytische biologie. Deze nanometer-formaat proteïnen vormen normale poriën in lipidemembranen en worden veel gebruikt voor enkelvoudige molecuul DNA en RNA sequencing. Ze hebben een aanzienlijk potentieel om een ​​breed scala aan sensing en sequencing toepassingen te bevorderen door ze uit gespecialiseerde laboratoria te halen en in draagbare apparaten te plaatsen. Huidige benaderingen voor het ontwerpen van nanoporie sensoren zijn echter beperkt tot natuurlijk voorkomende proteïnen, die zijn geëvolueerd voor zeer verschillende functies en geen ideale startpunten zijn voor sensorontwikkeling.

Onderzoek onder leiding van het VIB-VUB Centrum voor Structurele Biologie (België) en de University of Washington School of Medicine (VS) is de uitdaging aangegaan om deze proteïnevaten helemaal opnieuw te ontwerpen, met als uiteindelijke doel om de vorm en chemie op moleculair niveau te beheersen.

Met behulp van computationeel ontwerp ontwikkelden de onderzoekers methoden om stabiele nanoporekanalen te ontwerpen met instelbare porievormen, -groottes en -geleiding. Vergeleken met natuurlijke poriën was het signaal dat door de ontworpen TMB’s werd gegenereerd opmerkelijk stabiel en stil. Medewerkers in het laboratorium van Sheena Radford (University of Leeds) en Sebastian Hiller (Biozentrum, University of Basel) ontdekten dat de ontwerpen gevouwen konden worden tot stabiele 3D-structuren. Dit opent de deur naar het de novo ontwerpen van nanoporekanalen die geschikt zijn voor veel interessante toepassingen in onderzoek en industrie.

“Deze ontwikkelingen zijn erg spannend. Toen we een paar jaar geleden met dit idee begonnen, dachten veel mensen dat het onmogelijk was, omdat het ontwerp en de vouwing van β-sheets ongelooflijk complex is, laat staan ​​in lipidemembranen. Nu hebben we aangetoond dat we nanoporiën met een hoog slagingspercentage succesvol kunnen ontwerpen, die een stabiele en reproduceerbare geleiding hebben,” zegt Dr. Anastassia Vorobieva, groepsleider bij het VIB-VUB Centrum voor Structurele Biologie.

Als volgende stap testten de onderzoekers hun ontwerpmethode. Nanoporiën die zeer kleine moleculen zoals metabolieten kunnen detecteren, zouden uiterst nuttige hulpmiddelen zijn voor metabolomische en diagnostische analyses, waarvoor momenteel grote, gespecialiseerde laboratoriumapparatuur nodig is. Het ontwerp van functionele sensoren voor kleine moleculen blijft een uitdaging vanwege de complexiteit van eiwit-ligandinteracties. Daarom moeten de poriën een zeer complementaire vorm hebben voor het kleine molecuul van belang.

Een team van het laboratorium van UW Medicine biochemieprofessor en HHMI-onderzoeker David Baker heeft met succes nieuwe eiwitten ontworpen die specifiek kleine-molecule metabolieten kunnen binden. Ze splitsten de eiwitten in drie delen en fuseerden de delen in de lussen van een TMB-porie. Ze ontdekten dat ze direct enkelvoudige-molecule bindingsgebeurtenissen konden detecteren met behulp van dergelijke constructies.

“Deze samenwerking is een geweldig voorbeeld van wat er mogelijk is met proteïneontwerp. In plaats van biomoleculen uit de natuur te hergebruiken, kunnen we nu de functies die we willen creëren op basis van eerste principes,” aldus Prof. Dr. David Baker, hoogleraar aan de University of Washington School of Medicine en HHMI-onderzoeker.

De positieve resultaten bewijzen dat nanopore design massaspectrometrie en andere analytische methoden kan aanvullen die grote labs en grote opstellingen vereisen, omdat de technologie kleiner en toegankelijker is. Hoewel we nog behoorlijk ver van dit punt verwijderd zijn, voorzien de onderzoekers een toekomst waarin draagbare apparaten met verschillende nanopores een scala aan metabolieten, eiwitten en kleine moleculen kunnen detecteren, of zelfs biomoleculaire sequenties kunnen uitvoeren.