Uitbreidingstechniek om structuren op nanoschaal in cellen in beeld te brengen, maakt beeldvorming met hoge resolutie toegankelijker

Een klassieke manier om structuren op nanoschaal in cellen in beeld te brengen is met krachtige, dure superresolutiemicroscopen. Als alternatief hebben MIT-onderzoekers een manier ontwikkeld om weefsel uit te breiden voordat het in beeld wordt gebracht – een techniek waarmee ze resolutie op nanoschaal kunnen bereiken met een conventionele lichtmicroscoop.

In de nieuwste versie van deze techniek hebben de onderzoekers het mogelijk gemaakt om weefsel in één stap twintigvoudig uit te breiden. Deze eenvoudige, goedkope methode zou voor bijna elk biologielaboratorium de weg kunnen vrijmaken om beeldvorming op nanoschaal uit te voeren.

“Dit democratiseert beeldvorming”, zegt Laura Kiessling, de Novartis hoogleraar scheikunde aan het MIT en lid van het Broad Institute of MIT en het Koch Institute for Integrative Cancer Research van Harvard en MIT.

“Zonder deze methode moet je, als je dingen met een hoge resolutie wilt zien, hele dure microscopen gebruiken. Met deze nieuwe techniek kun je dingen zien die je normaal niet met standaardmicroscopen zou kunnen zien. Het verkleint de kosten van beeldvorming omdat je dingen op nanoschaal kunt zien zonder dat je een gespecialiseerde faciliteit nodig hebt.”

Met de resolutie die met deze techniek wordt bereikt, namelijk ongeveer 20 nanometer, kunnen wetenschappers organellen in cellen zien, evenals clusters van eiwitten.

“Twintigvoudige expansie brengt je in het domein waarin biologische moleculen opereren. De bouwstenen van het leven zijn dingen op nanoschaal: biomoleculen, genen en genproducten”, zegt Edward Boyden, Y. Eva Tan Professor in Neurotechnologie aan het MIT; een professor in biologische technologie, mediakunsten en -wetenschappen, en hersen- en cognitieve wetenschappen; een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute; en lid van MIT’s McGovern Institute for Brain Research en Koch Institute for Integrative Cancer Research.

Boyden en Kiessling zijn de senior auteurs van de nieuwe studie, die verschijnt in Natuurmethoden. MIT-afgestudeerde student Shiwei Wang en Tay Won Shin Ph.D. zijn de hoofdauteurs van het artikel.

Eén enkele uitbreiding

Het laboratorium van Boyden heeft in 2015 expansiemicroscopie uitgevonden. De techniek vereist het inbedden van weefsel in een absorberend polymeer en het afbreken van de eiwitten die normaal weefsel bij elkaar houden. Wanneer water wordt toegevoegd, zwelt de gel op en trekt de biomoleculen uit elkaar.

De originele versie van deze techniek, die het weefsel ongeveer viervoudig uitbreidde, stelde onderzoekers in staat beelden te verkrijgen met een resolutie van ongeveer 70 nanometer. In 2017 heeft het laboratorium van Boyden het proces aangepast om een ​​tweede expansiestap op te nemen, waarmee een algehele twintigvoudige expansie werd bereikt. Dit maakt een nog hogere resolutie mogelijk, maar het proces is ingewikkelder.

“We hebben in het verleden verschillende 20-voudige uitbreidingstechnologieën ontwikkeld, maar deze vereisen meerdere uitbreidingsstappen”, zegt Boyden. “Als je die hoeveelheid uitbreiding in één stap zou kunnen doen, zou dat de zaken een stuk eenvoudiger kunnen maken.”

Met een twintigvoudige expansie kunnen onderzoekers met een conventionele lichtmicroscoop een resolutie bereiken van ongeveer 20 nanometer. Hierdoor kunnen ze celstructuren zoals microtubuli en mitochondriën zien, evenals clusters van eiwitten.

In de nieuwe studie wilden de onderzoekers een twintigvoudige expansie uitvoeren met slechts één enkele stap. Dit betekende dat ze een gel moesten vinden die zowel extreem absorberend als mechanisch stabiel was, zodat deze niet uit elkaar zou vallen als hij twintigvoudig werd uitgezet.

Om dat te bereiken gebruikten ze een gel samengesteld uit N,N-dimethylacrylamide (DMAA) en natriumacrylaat. In tegenstelling tot eerdere expansiegels die afhankelijk zijn van het toevoegen van een ander molecuul om verknopingen tussen de polymeerstrengen te vormen, vormt deze gel spontaan verknopingen en vertoont sterke mechanische eigenschappen.

Dergelijke gelcomponenten werden eerder gebruikt in protocollen voor expansiemicroscopie, maar de resulterende gels konden slechts ongeveer tienvoudig expanderen. Het MIT-team optimaliseerde de gel en het polymerisatieproces om de gel robuuster te maken en twintigvoudige expansie mogelijk te maken.

Om de gel verder te stabiliseren en de reproduceerbaarheid ervan te verbeteren, verwijderden de onderzoekers vóór de gelering zuurstof uit de polymeeroplossing, wat nevenreacties voorkomt die de verknoping verstoren. Deze stap vereist het laten stromen van stikstofgas door de polymeeroplossing, dat het grootste deel van de zuurstof in het systeem vervangt.

Zodra de gel is gevormd, worden bepaalde bindingen in de eiwitten die het weefsel bij elkaar houden, verbroken en wordt er water toegevoegd om de gel te laten uitzetten. Nadat de expansie is uitgevoerd, kunnen doeleiwitten in weefsel worden gelabeld en in beeld worden gebracht.

“Deze aanpak vergt misschien meer monstervoorbereiding vergeleken met andere superresolutietechnieken, maar het is veel eenvoudiger als het gaat om het eigenlijke beeldvormingsproces, vooral voor 3D-beeldvorming”, zegt Shin. “We documenteren het stapsgewijze protocol in het manuscript, zodat lezers er gemakkelijk doorheen kunnen gaan.”

Kleine structuren in beeld brengen

Met behulp van deze techniek konden de onderzoekers veel kleine structuren in hersencellen in beeld brengen, waaronder structuren die synaptische nanokolommen worden genoemd. Dit zijn clusters van eiwitten die op een specifieke manier zijn gerangschikt bij neuronale synapsen, waardoor neuronen met elkaar kunnen communiceren via de uitscheiding van neurotransmitters zoals dopamine.

In onderzoeken naar kankercellen brachten de onderzoekers ook microtubuli in beeld: holle buisjes die cellen hun structuur helpen geven en een belangrijke rol spelen bij de celdeling. Ze waren ook in staat om mitochondria (organellen die energie opwekken) en zelfs de organisatie van individuele nucleaire poriecomplexen (clusters van eiwitten die de toegang tot de celkern controleren) te zien.

Wang gebruikt deze techniek nu om koolhydraten in beeld te brengen, bekend als glycanen, die op celoppervlakken worden aangetroffen en de interacties van cellen met hun omgeving helpen controleren. Deze methode zou ook kunnen worden gebruikt om tumorcellen in beeld te brengen, waardoor wetenschappers een glimp kunnen opvangen van de manier waarop eiwitten in die cellen zijn georganiseerd, veel gemakkelijker dan voorheen mogelijk was.

De onderzoekers stellen zich voor dat elk biologielaboratorium deze techniek tegen lage kosten zou moeten kunnen gebruiken, omdat het afhankelijk is van standaard, kant-en-klare chemicaliën en gewone apparatuur zoals confocale microscopen en handschoenzakken, die de meeste laboratoria al hebben of waar ze gemakkelijk toegang toe hebben.

“Onze hoop is dat met deze nieuwe technologie elk conventioneel biologielaboratorium dit protocol kan gebruiken met hun bestaande microscopen, waardoor ze een resolutie kunnen benaderen die alleen kan worden bereikt met zeer gespecialiseerde en kostbare, ultramoderne microscopen”, zegt Wang. .