Genetisch gemanipuleerde celtherapieën met mRNA-lipidenanodeeltjes voor overdraagbare bloedplaatjes

Bloedplaatjestransfusies zijn essentieel bij het beheersen van bloedingen en hemostatische disfunctie, en kunnen worden uitgebreid tot celtherapie voor een verscheidenheid aan ziekten. De inspanningen om dergelijke celtherapieën te creëren vereisen dat onderzoekers donorbloedplaatjes modificeren om therapeutische eiwitten tot expressie te brengen. Momenteel zijn er echter nog steeds geen geschikte methoden voor het genetisch modificeren van bloedplaatjes die zijn verzameld bij bloeddonoren.

In een nieuwe studie gepubliceerd in Wetenschappelijke vooruitgangJerry Leung en een team van wetenschappers op het gebied van nanogeneeskunde, biochemie en moleculaire biologie aan de Universiteit van British Columbia, Canada, de Hokkaido Universiteit, Japan en verschillende instellingen in de VS beschreven een aanpak gebaseerd op voor bloedplaatjes geoptimaliseerde lipide nanodeeltjes die mRNA bevatten voor exogene eiwitexpressie in bloedplaatjes van mens en rat.

Toen het team de bibliotheek van mRNA-lipidenanodeeltjes testte, correleerde de resulterende exogene eiwitexpressie niet met bloedplaatjesactivatie. De getransfecteerde bloedplaatjes behielden de hemostatische functie en stapelden zich op in gebieden met vasculaire schade na transfusie bij ratten met het vermogen om het therapeutische potentieel van de bloedplaatjes uit te breiden.

Bloedplaatjes en hemostase

Bloedplaatjes zijn een integraal onderdeel van de hemostase en worden routinematig getransfundeerd om te herstellen hemostatisch evenwicht bij patiënten. Deze bloedplaatjes kunnen buiten indicaties zoals celtherapieën worden uitgebreid behandeling van sepsis, ontstekingen en artritis. Genetisch gemodificeerde bloedplaatjes kunnen nieuwe celtherapieën creëren die therapeutische eiwitten tot expressie brengen, die kunnen worden geïmplementeerd om donorbloedplaatjes te modificeren. Bestaande methoden van elektroporatie, virale vectoren en commerciële transfectie zijn er niet in geslaagd donorbloedplaatjes te bewerken en exogene eiwitten tot expressie te brengen.

Indirecte benaderingen kunnen exogene eiwitten tot expressie brengen in bloedplaatjes of bloedplaatjesachtige deeltjes door zich te richten op bloedplaatjesvoorloperstamcellen lentivirale vectoren. De van donoren afkomstige bloedplaatjes moeten functioneel worden aangepast om authentiek te zijn bloedplaatjesceltherapieën.

Eerdere pogingen om bloedplaatjes te transfecteren met lipide nanodeeltjes die mRNA bevatten, hebben de mogelijkheid aangetoond mRNA-afgifte in de bloedplaatjesterwijl de vooruitgang in de lipidenanodeeltjestechnologie het potentieel ervan heeft verbeterd een bredere demografie bereiken.

In dit werk rapporteerden Leung en collega’s mRNA-lipidenanodeeltjes vanwege hun vermogen om donorbloedplaatjes direct te transfecteren om exogene eiwitten tot expressie te brengen. Dergelijke bloedplaatjes kunnen worden gemodificeerd met mRNA-lipidenanodeeltjes om hun functie te behouden en zich lokaal op te hopen in wonden en de homeostase te reguleren na transfusie bij coagulopathische ratten.

Lipide nanodeeltjes vergemakkelijken exogene eiwitexpressie in bloedplaatjes

Om de effectieve transfectiemethoden voor bloedplaatjes te identificeren, leverde het team mRNA af dat codeerde voor een enzym NanoLuc-luciferase (NanoLuc) met behulp van verschillende transfectiemiddelen en hun expressie gemeten. Hoewel NanoLuc niet werd gedetecteerd in bloedplaatjes die waren behandeld met vrij mRNA zonder een transfectiemiddel of met behulp van commerciële mRNA-afgiftemiddelen, maakte het proces de opname van grote hoeveelheden mRNA in de bloedplaatjes mogelijk.

Leung en team ontdekten NanoLuc-expressie door gebruik te maken van een mRNA-lipide-nanodeeltjesformulering die leek op het kleine interfererende RNA-lipide-nanodeeltje waarvan klinisch is bewezen dat het de ziekte behandelt erfelijke amyloïdose. Het team vergeleek de hoeveelheid bloedplaatjesactivatie na transfectie van mRNA-lipidenanodeeltjes met onbehandelde bloedplaatjes.

Om de mRNA-lipide-nanodeeltjesformulering te identificeren die het meest geschikt is voor het transport van bloedplaatjes, hebben ze drie belangrijke componenten geoptimaliseerd; ioniseerbare lipiden, linkerlipiden en het polyethyleenglycollipide. Ze screenden 10 ioniseerbare en twee permanent kationische lipiden en maten hun eiwitexpressie, mRNA-opname en activering om de eiwitsynthese te ondersteunen.

Acties van de gefunctionaliseerde lipide-nanodeeltjes in het laboratorium

Om te onderzoeken hoe de combinatie van ioniseerbare en hulplipiden synergetische effecten heeft om de eiwitexpressie te verbeteren en tegelijkertijd de activering van bloedplaatjes te minimaliseren, bestudeerde het team twee door de FDA goedgekeurde ioniseerbare lipiden. Naast hun lipidensamenstelling speelden de mRNA-elementen een belangrijke rol bij het bevorderen van de efficiëntie exogene eiwitsynthese. De lipidenanodeeltjes die helperlipiden met een fosfocholinekop bevatten, naast lipiden met vertakte of onverzadigde staartgroepen, waren het meest geschikt voor transfectie van bloedplaatjes en om hogere expressieniveaus te bewerkstelligen.

Van de in dit werk geteste RNA-modificaties merkten Leung en collega’s ongewijzigd op uridineof pseudouridine om hogere expressieniveaus van fluorescentie te vergemakkelijken. Vervolgens observeerden ze of de expressie van fluorescentie afhing van de mate van bloedplaatjesactivatie, of van de hoeveelheid afgegeven RNA, wat ze bestudeerden met behulp van een correlatiematrixanalyse.

Hoewel de fluorescentie-expressie niet sterk correleerde met het niveau van bloedplaatjes aan het oppervlak of met de opname van mRNA, merkten ze een milde positieve correlatie op tussen de hoeveelheid afgegeven RNA en de activering van bloedplaatjes. Omdat de expressie van NanoLuc niet sterk correleerde met de hoeveelheid bloedplaatjes aan het oppervlak of met de opname van mRNA, testte het team de mogelijkheid om de expressie ervan te beïnvloeden door bloedplaatjes te activeren met behulp van agonisten voor en na transfectie van mRNA-lipidenanodeeltjes.

Bloedplaatjesbehandeling om verdunningscoagulopathie te modelleren

Bloedplaatjes gestimuleerd met adenosinedifosfaatZo had verknoopt collageen-gerelateerd peptide of trombine voorafgaand aan de behandeling met mRNA-lipide-nanodeeltjes aanzienlijk minder fluorescentie-expressie. Toen Leung en het team de bloedplaatjes langer dan twee uur met agonisten stimuleerden, ondergingen ze een substantiële herschikking van de bloedplaatjes. transcriptoom en proteoom. De resultaten toonden aan dat de translatie van exogeen mRNA geen activatie van bloedplaatjes vereiste.

Toen het team bloedplaatjes behandelde met mRNA-lipidenanodeeltjes, behielden ze de hemostatische functie in vitro en vertoonden ze een hoge gevoeligheid voor hun fysieke en chemische omgeving. Het team onderzocht of de bloedplaatjes nog steeds geactiveerd konden worden na transfectie van mRNA-lipide-nanodeeltjes en mat hun activeringstoestand en reactie op fysiologische agonisten.

Het team testte het vermogen van getransfecteerde bloedplaatjes om hun potentieel om bij te dragen aan de stevigheid en snelheid van stolselvorming te behouden met behulp van een model van rotatietrombo-elastometrie en een ex vivo model om de bloedplaatjesactiviteit in volbloed te testen. De onderzoekers modelleerden verdunningscoagulopathie gebruik van verdund volbloed en geprepareerde bloedplaatjes in een transfusiepakket.

Toen ze het transfusiepakket combineerden met verdund volbloed om de ziekte te modelleren zoals deze bij een patiënt voorkomt, merkten ze op dat de lipidenanodeeltjes in vitro geen invloed hadden op de bloedplaatjescoagulopathie. Daarnaast onderzocht het team de expressie van bloedplaatjes getransfecteerd met mRNA-lipidenanodeeltjes uitgedrukt met NanoLuc, gecirculeerd en gelokaliseerd in wondplaatsen na transfusie bij coagulopathische knaagdieren.

Vooruitzichten

Op deze manier richtten Jerry Leung en collega’s de afgifte van moleculen en celtherapieën op interessante plaatsen in het vaatstelsel door gebruik te maken van de van nature competente bloedplaatjes die deze taak inherent kunnen uitvoeren. Het team ontwikkelde voor bloedplaatjes geoptimaliseerde lipidenanodeeltjes en mRNA voor succesvolle eiwitexpressie, terwijl de circulaire functie van bloedplaatjes en lokale accumulatie op de interessante plaats in het vaatstelsel werden gepresenteerd.

Het is mogelijk om de afgifte van nucleïnezuren en exogene translatie te bereiken met behulp van voor bloedplaatjes geoptimaliseerde mRNA-lipidenanodeeltjes om bloedplaatjes te verbreden en te engineeren voor een verscheidenheid aan klinische toepassingen. Dergelijke donorbloedplaatjes, ontwikkeld met mRNA-lipidenanodeeltjes, kunnen acute bloedingsstoornissen behandelen met bredere toepassingen in de oncologie. Deze bloedplaatjes die zijn getransfundeerd met geoptimaliseerde mRNA-lipidenanodeeltjes zijn functioneel transfusiebaar en kunnen zich ophopen op de plaats van het vaatstelsel voor effectieve bloedplaatjestherapieën om hematologische stoornissen te moduleren.