Het volgen van de dynamiek van biomoleculen met optofluidische antennes

Om fundamentele processen in de levenswetenschappen op moleculair niveau beter te begrijpen, is de nauwkeurige observatie van de dynamiek van afzonderlijke moleculen van het grootste belang. De huidige technieken gebaseerd op fluorescentiemetingen in waterige oplossingen zijn echter niet in staat veranderingen in de moleculaire structuur met voldoende temporele resolutie te volgen.

Natuurkundigen van het Max Planck Instituut voor de Wetenschap van Licht (MPL) zijn er nu in geslaagd een fotonische structuur die bekend is uit de kwantumoptica – de vlakke optische antenne – verder te ontwikkelen voor gebruik in waterige media om dynamische processen te monitoren. Hierdoor kunnen conformationele veranderingen van individuele biomoleculen worden waargenomen met de hoogste temporele resolutie.

Om deze resolutie te bereiken verzamelt de zogenaamde “optofluidische antenne” de fotonen die worden uitgezonden door individuele fluorescerende moleculen met een efficiëntie van ongeveer 85%. Met zo'n hoge efficiëntie zijn de onderzoekers in staat een tijdresolutie in het microsecondebereik te bereiken. Het apparaat kan eenvoudig worden geïntegreerd in veel bestaande microscopieopstellingen en voegt een extra hulpmiddel toe dat een hoge temporele resolutie in het laboratorium biedt.

Het bestuderen van de gecompliceerde interne dynamiek van biomoleculen in een vloeibare omgeving met een resolutie van één molecuul is van groot belang voor de levenswetenschappen.

Fluorescentiemetingen zijn momenteel de hoeksteentechniek voor het ontcijferen van snelle en langzame dynamische processen. Hier worden speciale delen van de biomoleculen gemarkeerd met fluorescerende kleurstofmoleculen. Wanneer ze worden aangeslagen met laserlicht, worden veranderingen in hun positie ten opzichte van elkaar gedetecteerd door de uitgezonden fotonen te meten. De verzamelmethodologie beperkt echter het aantal fluorescentiefotonen dat per tijdsinterval kan worden geregistreerd, waardoor de temporele resolutie wordt beperkt.

In productie, gepubliceerd in Natuurcommunicatietoont het team onder leiding van professor Stephan Götzinger en professor Vahid Sandoghdar een geheel nieuwe, zeer efficiënte meetmethode die is gebaseerd op structuren die bekend zijn uit de vaste-stof-kwantumoptica.

Natuurkundigen ontwikkelden het concept van de planaire optische antenne ongeveer 10 jaar geleden en in tegenstelling tot conventionele optische antennes kan een planaire antenne worden gerealiseerd zonder metalen nanostructuren. Door een slimme aanpassing zijn de nieuwe optofluidische antennes in staat fotonen te verzamelen die worden uitgezonden door een enkel biomolecuul in oplossing met een extreem hoog rendement (85%).

De antenne bestaat uit een glazen substraat en een honderden nanometer dikke waterlaag met daarin de te onderzoeken biomoleculen. Het dunne laagje water wordt gecreëerd door een micropipet die slechts een paar honderd nanometer boven het substraat is geplaatst. Door een gedefinieerde druk uit te oefenen, wordt de vorm van de watermeniscus in de pipet gecontroleerd.

De axiale grens van de waterlaag dwingt de moleculen om door het midden van het laserfocus te diffunderen en verhoogt zo de zogenaamde helderheid. De antenne verhoogt het fluorescentiesignaal van de moleculen ongeveer vijfvoudig. Tegelijkertijd vertraagt ​​het water-lucht-grensvlak de diffusie van moleculen, terwijl de antennegeometrie de kans vergroot dat een molecuul terugkeert naar de focus.

De MPL-wetenschappers demonstreren de prestaties van de optofluidische antenne samen met de groep van professor Claus Seidel, Universiteit van Düsseldorf, door de verandering in conformiteit van een specifiek gerangschikt DNA te onderzoeken: de DNA-vierwegverbinding.

Twee van de benen van de kruising zijn gemarkeerd met een Förster-resonantie-energieoverdrachtspaar (FRET), waarbij het aantal fotonen dat door elk van de twee FRET-partners wordt uitgezonden, verandert met de afstand tussen de twee benen. Met behulp van FRET-trajecten konden de onderzoekers bewijzen dat een vermoedelijke conformationele toestand niet voorkomt en een bovengrens voor de levensduur ervan bieden. De nieuwe antenne kan de dynamiek van DNA-vierwegkruising volgen met een temporele resolutie van slechts enkele microseconden.

“Onze optofluidische antenne werkt zo goed dankzij de verbeterde efficiëntie van het verzamelen van fotonen van langzamer diffunderende moleculen in het ruimtelijk beperkte kanaal”, zegt professor Stephan Götzinger.

“De antenne is een krachtig apparaat voor onderzoek in de levenswetenschappen. Hij is niet alleen eenvoudig te gebruiken, maar kan ook eenvoudig worden geïntegreerd in veel bestaande microscopie-opstellingen”, voegt professor Vahid Sandoghdar toe.